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你是路人甲銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
293細(xì)胞轉(zhuǎn)染時siRNA與Lipofectamine2000的比例
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最近開始做siRNA轉(zhuǎn)染，遇到了很多問題，懇請各位轉(zhuǎn)染大神幫助！ 我要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系是轉(zhuǎn)染最常用293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染體系是6孔板和6 cm皿，目的是要敲低一個分子量300多kD的蛋白質(zhì)，siRNA和Lipofectamine2000均是購買而得。轉(zhuǎn)染前檢測了siRNA的量，確定沒有降解。EP管和kit均是無RNA酶的。轉(zhuǎn)染過程中使用的培養(yǎng)基是OPTI-MEM，種293細(xì)胞及換液用的培養(yǎng)基均為不含青鏈霉素的10%FBS的MEM培養(yǎng)基，293細(xì)胞匯合度為80%~90%。 根據(jù)說明書的推薦用量（75 pmol siRNA:7.5 uL Lipo2000）、做過嘗試，轉(zhuǎn)染6 h后換液，24 h、48 h后通過IF檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)（因?yàn)閷?shí)驗(yàn)需要一些熒光照片，鑒于已有抗體的局限性，未對siRNA進(jìn)行熒光標(biāo)記），但是都沒有達(dá)到轉(zhuǎn)染效果。 |
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西門吹雪170: 金幣+4, 鼓勵回帖交流 2019-02-25 21:58:05
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| 最好在轉(zhuǎn)染過程中用無血清培養(yǎng)基，血清會對轉(zhuǎn)染效率有一定的影響。2、轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度最好在60-80%，像我們平時使用的RFect sRNA Transfection Reagent對細(xì)胞幾乎沒有毒性，要求我們的細(xì)胞密度40%就可以了。如果細(xì)胞活性比較好，抗毒性比較好,試劑毒性小的時候可以降低細(xì)胞融合度，但是要注意a、細(xì)胞出于對數(shù)分裂期的時候轉(zhuǎn)染效率是最好的（一般在傳代后18-24h效果比較好），b、細(xì)胞凋亡后能保持一定的細(xì)胞數(shù)（收蛋白，或是RNA，細(xì)胞太少是不行的）。3、轉(zhuǎn)染試劑和siRNA比例問題，這個一般在1-5：1之間，因?yàn)榧?xì)胞種系等的不同，這個一般要自己摸索的，嚴(yán)格按照說明書做，馬虎不得，特別是時間的控制也特別重要。 |
2樓2019-02-25 16:59:33
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