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你是路人甲銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
293細胞轉染時siRNA與Lipofectamine2000的比例
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最近開始做siRNA轉染，遇到了很多問題，懇請各位轉染大神幫助！ 我要轉染的細胞系是轉染最常用293細胞，轉染體系是6孔板和6 cm皿，目的是要敲低一個分子量300多kD的蛋白質(zhì)，siRNA和Lipofectamine2000均是購買而得。轉染前檢測了siRNA的量，確定沒有降解。EP管和kit均是無RNA酶的。轉染過程中使用的培養(yǎng)基是OPTI-MEM，種293細胞及換液用的培養(yǎng)基均為不含青鏈霉素的10%FBS的MEM培養(yǎng)基，293細胞匯合度為80%~90%。 根據(jù)說明書的推薦用量（75 pmol siRNA:7.5 uL Lipo2000）、做過嘗試，轉染6 h后換液，24 h、48 h后通過IF檢測目標蛋白的表達（因為實驗需要一些熒光照片，鑒于已有抗體的局限性，未對siRNA進行熒光標記），但是都沒有達到轉染效果。 |
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| 最好在轉染過程中用無血清培養(yǎng)基，血清會對轉染效率有一定的影響。2、轉染時細胞密度最好在60-80%，像我們平時使用的RFect sRNA Transfection Reagent對細胞幾乎沒有毒性，要求我們的細胞密度40%就可以了。如果細胞活性比較好，抗毒性比較好,試劑毒性小的時候可以降低細胞融合度，但是要注意a、細胞出于對數(shù)分裂期的時候轉染效率是最好的（一般在傳代后18-24h效果比較好），b、細胞凋亡后能保持一定的細胞數(shù)（收蛋白，或是RNA，細胞太少是不行的）。3、轉染試劑和siRNA比例問題，這個一般在1-5：1之間，因為細胞種系等的不同，這個一般要自己摸索的，嚴格按照說明書做，馬虎不得，特別是時間的控制也特別重要。 |
2樓2019-02-25 16:59:33
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