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反對派銀蟲 (正式寫手)
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逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后,為何要滅活逆轉(zhuǎn)錄酶?
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invitrogen公司的M-MLV Reverse Transcriptase進行逆轉(zhuǎn)錄疑問: 1. 程序上的問題。37℃ 2min→25℃ 10min→37℃ 50min。 中間這個25℃是起什么作用? 2. 反應(yīng)結(jié)束后為何要70 ℃,15分鐘將逆轉(zhuǎn)錄酶滅活。 3.逆轉(zhuǎn)錄這一步的的成分里面哪些東西會影響后續(xù)的 qPCR? |
金蟲 (著名寫手)
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關(guān)于要滅活逆轉(zhuǎn)錄酶活性還有一個重要原因可能是RT競爭性抑制DNA pol,推測是影響DNA pol結(jié)合到cDNA模板。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
金蟲 (著名寫手)
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一般逆轉(zhuǎn)錄時用的隨機引物才會25度。逆轉(zhuǎn)錄酶特別是mmlv還有末端轉(zhuǎn)移酶活性,可能會在合成的cDNA末端添加堿基c詳細可以參考smart。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的離子,殘留引物都可能影響后續(xù)擴增,所以一般下一步做PCR的話,逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物最好不要超過PCR反應(yīng)體系十分之一。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
銀蟲 (正式寫手)
銀蟲 (正式寫手)
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