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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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[交流]
跑了那么多次WB，你真的知道它在測什么嗎
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做生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的小伙伴，肯定每天都在和蛋白質(zhì)打交道 — 跑 WB 檢測目的蛋白表達(dá)、做 Co-IP 找互作蛋白、用質(zhì)譜做全蛋白鑒定。都離不開蛋白質(zhì)，那么它到底有多重要呢？1蛋白質(zhì)有多重要？ 蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，和核酸、糖類、脂質(zhì)共同構(gòu)成細(xì)胞，是基因指令的最終執(zhí)行者。1. 基因的翻譯產(chǎn)物：我們常說 “基因決定性狀”，但基因不會(huì)直接干活。DNA 轉(zhuǎn)錄成 mRNA，mRNA 再翻譯出蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)才是真正實(shí)現(xiàn)功能的工具。比如A基因編碼了肌動(dòng)蛋白，最終是肌動(dòng)蛋白構(gòu)成細(xì)胞骨架，支撐肌肉收縮；基因編碼了 “酶”，最終是酶催化體內(nèi)的生化反應(yīng)，維持新陳代謝。2. 幾乎所有生命活動(dòng)，都離不開蛋白質(zhì)： 催化反應(yīng)； 信號(hào)傳導(dǎo)；結(jié)構(gòu)支撐；免疫防御等重要功能 3. 蛋白質(zhì)的異常，是疾病的信號(hào)燈很多疾病的本質(zhì)，就是蛋白質(zhì)出了問題： 癌癥是原癌基因編碼的蛋白過度表達(dá)，抑癌基因編碼的蛋白失活，導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖；神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病，是 β- 淀粉樣蛋白異常聚集，損傷神經(jīng)元等。2為什么必須檢測蛋白質(zhì)？ 很多人會(huì)問：既然蛋白質(zhì)由基因編碼，那檢測基因不就行了嗎？實(shí)際上真的不行！因?yàn)?“基因表達(dá)≠蛋白表達(dá)”，中間差了兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)：轉(zhuǎn)錄調(diào)控和翻譯后修飾。1. 轉(zhuǎn)錄水平≠翻譯水平同一個(gè)基因，在不同細(xì)胞、不同環(huán)境下的轉(zhuǎn)錄效率不同，mRNA 的穩(wěn)定性也不同，最終翻譯出的蛋白量天差地別。比如在某中，A基因的 mRNA 可能沒變化，但蛋白表達(dá)量顯著上調(diào) —— 這種差異，只有檢測蛋白才能發(fā)現(xiàn)。2. 翻譯后修飾，決定蛋白的 “活性開關(guān)”蛋白翻譯出來后，還會(huì)經(jīng)歷磷酸化、乙�；�、泛素化等修飾，這些修飾直接決定蛋白的活性、定位和壽命。比如同樣是一個(gè)激酶蛋白，磷酸化之后才會(huì)被激活，才能磷酸化下游底物；去磷酸化后就會(huì)失活。這種修飾的變化，基因檢測看不出來，必須靠蛋白檢測（比如 WB、質(zhì)譜）才能發(fā)現(xiàn)。 3檢測蛋白質(zhì)，到底在測什么？ WB 實(shí)驗(yàn)是基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特性，特異性檢測線性表位 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次：一級(jí)結(jié)構(gòu)：氨基酸的線性排列順序，靠肽鍵連接，是蛋白的基礎(chǔ)骨架。WB 檢測的線性表位就是這個(gè)，蛋白變性也不會(huì)消失。二級(jí)結(jié)構(gòu)：氨基酸鏈局部折疊形成的 α- 螺旋、β- 折疊等構(gòu)象，靠氫鍵維持，是構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。三級(jí)結(jié)構(gòu)：整條肽鏈折疊成的穩(wěn)定三維空間結(jié)構(gòu)，靠氫鍵、疏水鍵等維持。這是蛋白具有生物活性的基本形態(tài)，構(gòu)象表位就存在于此。 四級(jí)結(jié)構(gòu)：多條有獨(dú)立三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈（亞基）聚合形成的復(fù)合體結(jié)構(gòu)，不是所有蛋白都有，能讓蛋白功能更高效。4WB 是如何檢測線性表位的？ WB 的實(shí)驗(yàn)流程，每一步都在為線性表位檢測鋪路，目的就是為了破壞蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)，暴露線性表位 1.樣品變性：實(shí)驗(yàn)中我們會(huì)用 SDS + 煮沸處理樣品。SDS 是強(qiáng)效變性劑，既能讓蛋白分子帶上均勻負(fù)電，還能強(qiáng)行拆開蛋白的二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)，把它還原成一條舒展的線性多肽鏈。原本藏在蛋白內(nèi)部的線性表位，就被完全暴露出來。2. 電泳分離：變性后的蛋白鏈，會(huì)在電場作用下根據(jù)分子量大小在凝膠中分離。不同蛋白的線性表位，也會(huì)跟著對(duì)應(yīng)的多肽鏈，跑到凝膠的特定位置。3. 轉(zhuǎn)膜孵育：蛋白轉(zhuǎn)移到膜上后，我們加入的一抗是針對(duì)特定線性表位序列設(shè)計(jì)的。它就像一把鑰匙，只認(rèn)對(duì)應(yīng)的氨基酸序列鎖 —— 只有膜上存在目標(biāo)線性表位，抗體才會(huì)與之結(jié)合，最終顯影出清晰條帶。WB 檢測線性表位的本質(zhì)，是利用變性手段打破蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)，讓隱藏的線性氨基酸序列暴露，再通過特異性抗體實(shí)現(xiàn)識(shí)別。 |
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