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科研戰(zhàn)神來(lái)了新蟲(chóng) (小有名氣)
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實(shí)驗(yàn)干貨 | 一文學(xué)會(huì)透免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟和圖像分析
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實(shí)驗(yàn)原理免疫熒光（Immunofluorescence，IF）是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一種強(qiáng)大的技術(shù)，主要原理是利用熒光標(biāo)記的抗體作為探針對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)特定抗原進(jìn)行定位和定性分析。主要包括直接法和間接法。直接法是蛋白和標(biāo)記熒光素一抗結(jié)合，間接法是蛋白和一抗結(jié)合，然后再與帶有熒光基團(tuán)的二抗識(shí)別，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光。 實(shí)驗(yàn)步驟（以貼壁細(xì)胞為例）流程：細(xì)胞爬片→固定→抗原修復(fù)（可選）→透化（可選）→封閉→染色→復(fù)染→封片→鏡檢 注意事項(xiàng)： •注意細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞密度，單層細(xì)胞生長(zhǎng)，密度75%-85%•全程操作記得區(qū)分爬片的正反面。有細(xì)胞的為正面 •全程操作輕柔，避免洗脫細(xì)胞 •加入熒光抗體后后續(xù)流程全避光操作 一、細(xì)胞爬片 1. 將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板和多聚賴氨酸處理6孔板配套無(wú)菌圓形爬片拿入生物安全柜中 2. 彎型鑷子噴適量酒精后用酒精燈消毒，將爬片放入6孔板中（逐片緊挨放入） 3. 沿壁慢慢加入2mL 細(xì)胞培養(yǎng)基，用槍頭輕輕按蓋玻片，使其與6孔板底部緊密接觸，不要產(chǎn)生氣泡 4. 37度CO2培養(yǎng)箱靜置幾分鐘（期間消化細(xì)胞，離心） 5. 用槍頭吸干培養(yǎng)基（槍頭放蓋玻片間隙，最后可將plate傾斜吸干） 6. 沿壁慢慢加入2mL 細(xì)胞懸液，輕拍側(cè)壁使蓋玻片與6孔板底部之間氣泡排出，用槍頭輕輕按蓋玻片，使其與6孔板底部緊密接觸，避免產(chǎn)生氣泡，蓋玻片之間不能重疊 7. 37度CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)約12小時(shí)后，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)密度，大約75%單層細(xì)胞即可開(kāi)始免疫熒光染色實(shí)驗(yàn) 二、固定、抗原修復(fù)和透化1. 固定：4%多聚甲醛孵育細(xì)胞10min（或者用放在-20℃預(yù)冷的甲醇孵育5min）。用提前在4℃或者冰上預(yù)冷的PBS洗三次，不要太用力。 2. 抗原修復(fù)：（可選步驟）在抗原修復(fù)緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行加熱處理后，有些抗體的效果會(huì)更好。 詳細(xì)流程如下：① 將抗原修復(fù)緩沖液（100 mM Tris，5% [w/v] 尿素，pH 9.5）預(yù)熱至 95 ℃。 ② 用小型寬頭鑷子小心將蓋玻片置于蓋玻片染色缸內(nèi)的抗原修復(fù)緩沖液中，記下長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋玻璃面。 ③ 在 95 ℃下加熱蓋玻片10 分鐘。 ④ 從抗原修復(fù)緩沖液中取出蓋玻片，浸入6孔組織培養(yǎng)板內(nèi)的PBS溶液中，保持長(zhǎng)有細(xì)胞的一面朝上。 ⑤ 用 PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 分鐘。 3. 透化：胞內(nèi)蛋白需要，膜蛋白不需要。常規(guī)透化劑是0.1% Triton X-100 的PBS。透化10分鐘然后用PBS洗干凈。 三、封閉和免疫染色 1. 用 1% BSA、22.52 mg/mL 甘氨酸的 PBST (PBS + 0.1% Tween 20) 孵育細(xì)胞 30 分鐘，封閉抗體的非特異性結(jié)合（替代封閉液可用來(lái)源于產(chǎn)生二抗的物種的 10% 血清）。 2. 吸走封閉液，加入稀釋后的一抗室溫 1 小時(shí)。 3. 倒出溶液，用 PBST洗滌細(xì)胞 3 次，每次 5 分鐘。 4. 用二抗（溶于抗體稀釋液中）避光孵育細(xì)胞 室溫1 小時(shí)。 5. 倒出二抗溶液，用 PBST 避光洗滌細(xì)胞 3 次，每次 5 分鐘。 四、多色染色（可選步驟） 1. 要檢測(cè)同一個(gè)樣品中兩種或多種抗原的共同分布情況，需要使用雙重免疫熒光流程。該流程可在混合物中同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，也可逐個(gè)抗原依次進(jìn)行檢測(cè)。 2. 確�？贵w來(lái)源于不同物種并且這些抗體有相應(yīng)的二抗。例如，抗抗原 A 的兔抗體和抗抗原 B 的鼠抗體。也可使用偶聯(lián)至不同熒光團(tuán)的直標(biāo)一抗。 五、復(fù)染、封片和鏡檢在樣本上滴加DAPI工作液，避光，室溫，孵育10分鐘；去除DAPI工作液，用緩沖液TBST洗滌1次，5分鐘； 用緩沖液TBS洗滌3次，每次5分鐘； 加入抗熒光衰減封片劑后，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。 圖像分析——ImageJ詳細(xì)分析流程如下：1. ImageJ打開(kāi)需要分析的熒光圖片2. RGB格式的圖像，先提取對(duì)應(yīng)通道，Image-Color-Split channels（ImageJ只能拆成“紅綠藍(lán)”三個(gè)通道）。如果圖像是8 bit，16 bit, 32 bit則直接進(jìn)行下一步分析3. 調(diào)整閾值：Image-Adjust-Threshold，紅色區(qū)域?yàn)榻y(tǒng)計(jì)區(qū)4. 設(shè)置測(cè)量參數(shù)：Analyze-Set-Measurements,勾選Area, Mean gray value, Min & max gray value, Limit to threshold |
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