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艾因斯新蟲 (小有名氣)
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[交流]
鉭納米顆粒增強(qiáng)明膠水溶膠復(fù)合材料的成骨誘導(dǎo)性
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介紹 可生物再吸收的聚合物材料作為骨組織再生的植入物已經(jīng)引起了極大的興趣，因為它們相對于傳統(tǒng)的金屬裝置顯示出顯著的優(yōu)點，包括可生物降解性、柔韌性和易于改性引入的可能性。 骨損傷可以由幾種病理條件產(chǎn)生，當(dāng)它們超過骨自愈能力的臨界尺寸時，需要外部干預(yù)來促進(jìn)骨再生和恢復(fù)正常的骨功能。由于人口老齡化，對骨組織愈合和再生的新策略和先進(jìn)材料的需求逐年增加。由合成聚合物制成的骨引導(dǎo)再生裝置，包括聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)及其共聚物聚丙交酯-共-乙交酯(PLGAs)，代表了骨組織工程和骨替代物的令人鼓舞的解決方案，其特征和要求已在許多綜述論文中指出。良好的生物相容性、適當(dāng)?shù)臋C(jī)械性能、易于加工、合適的降解速率和優(yōu)異的骨傳導(dǎo)能力是這類聚合物的主要特征。 鉭以多孔植入物的形式用于骨科應(yīng)用，被證明具有生物活性、骨誘導(dǎo)性，并且能夠比鈦植入物更好地支持人類成骨細(xì)胞的生長和分化。鉭納米粒子目前被用作X射線計算機(jī)斷層成像的納米探針和藥物輸送目的。 實驗 材料 聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)，PLGA，(丙交酯:乙交酯=75:25，Mw=76000-15000 Da，RESOMER RG 756 S)；聚乙二醇，PEG，(Mw=1500 Da)；來自豬皮的A型明膠(300 Bloom，適馬奧爾德里奇)。鉭納米顆粒(平均顆粒尺寸= 50-80 nm，純度> 99%)。二氯甲烷(DCM)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。 靜電紡絲墊的制造 將PLGA以20% w/v的濃度溶解在DCM/DMF (70/30 v/v)中，并在室溫(RT)下攪拌15分鐘。將PEG以65% w/v的濃度溶解在雙蒸水中，并在室溫下攪拌15分鐘。制備并電紡四種不同的溶液，其重量比PLGA/PEG = 100/0、95/5、90/10、80/20。 獲得厚度在50-70μm范圍內(nèi)的墊子，并在干燥器中儲存過夜以除去殘留溶劑。 水凝膠的制備 考慮了兩種不同的明膠基溶液  I)“明膠溶液”，含有A型明膠和京尼平，用作交聯(lián)劑，和(ii)“明膠-鉭分散體”，除明膠和京尼平外，還含有鉭NP。水凝膠/纖維復(fù)合支架的制備 PolyGelTa水凝膠/纖維復(fù)合支架的制造過程如下：將42℃下的“明膠-鉭分散體”( 8 mL)倒入皮氏培養(yǎng)皿(內(nèi)徑= 5.4 cm)中，并在4℃下保持5分鐘以形成凝膠。然后將從墊子上切下的直徑為5 cm的電紡樣品放在明膠層上。 將另外8毫升42℃的“明膠-鉭分散體”倒在電紡墊上，并將所得材料在4℃保持24小時。在室溫下在層流下蒸發(fā)溶劑24小時后，從溶劑澆鑄法獲得支架。使用“明膠溶液”代替“明膠-鉭分散體”,按照相同的程序生產(chǎn)PolyGel復(fù)合支架。 表征方法 使用TA Instrument TGA Q500分析儀從室溫至600℃對電紡墊進(jìn)行熱重分析(TGA ),在N₂氣氛中以10 ℃/ min的加熱速率進(jìn)行。使用TA Instruments Q100 DSC裝置，在-90℃至120℃的N₂氣氛中，以20℃/min的加熱掃描速率，對電紡氈進(jìn)行DSC測量；在第二次加熱掃描中，在玻璃化轉(zhuǎn)變熱容階躍的一半高度處獲取Tg。 溶脹度和明膠釋放的測定 將復(fù)合支架在磷酸鹽緩沖液(PB，0.1 M，pH 7.4)中浸泡1分鐘至300分鐘后，測量膨脹度。用濾紙擦拭濕樣品以除去多余的液體。根據(jù)等式計算膨脹度（其中ww和wd分別是濕樣品和風(fēng)干樣品的重量）。對于明膠釋放的測定，將100 mg復(fù)合支架浸入37℃的5ml PB中。 體外測試 為了評估材料的生物安全性，第一個評估是細(xì)胞毒性測試，通過實驗材料和人成骨細(xì)胞樣細(xì)胞之間的直接接觸在較短的實驗時間(72小時)內(nèi)進(jìn)行。使用了陽性和陰性對照。在評估陰性細(xì)胞毒性后，在生物材料上培養(yǎng)人類間充質(zhì)干細(xì)胞達(dá)14天，進(jìn)行生物活性的體外模型。 細(xì)胞毒性試驗:在補(bǔ)充有10% FCS和抗生素(100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)人成骨細(xì)胞樣細(xì)胞MG63。通過胰蛋白酶消化從培養(yǎng)瓶中分離細(xì)胞，并通過臺盼藍(lán)染料排斥試驗檢查細(xì)胞數(shù)量和生存力。 生物活性測試-體外模型:在MSCBM(添加了生長試劑盒的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，ATCC)中擴(kuò)增第2代的正常人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。傳代后，對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，并以3×10⁴細(xì)胞/mL的濃度接種在含有PolyGel和PolyGelTa無菌樣品的24孔板中。 生物活性測試-細(xì)胞活力和形態(tài)學(xué):在第3、7、10和14天進(jìn)行評估，以評估生物材料和CTR上的細(xì)胞活力和hMSC活性。通過WST1試驗測量生存力，通過活/死試驗觀察細(xì)胞形態(tài)。 生物活性測試-基因表達(dá):通過評估所有組中最常見的成骨細(xì)胞分化標(biāo)志的基因表達(dá)來研究生物活性。 結(jié)果與討論 這項工作的基本原理是制備創(chuàng)新的可吸收的聚合物支架，該支架可能適用于骨組織再生的框架。通過將PLGA電紡氈的柔韌性和抗水解性與京尼平交聯(lián)的明膠的仿生特性和鉭的優(yōu)異生物活性和骨誘導(dǎo)特性結(jié)合起來。 該復(fù)合支架由兩個用京尼平交聯(lián)并填充鉭納米顆粒的明膠水凝膠外層和一個PLGA內(nèi)層電紡纖維（作為增強(qiáng)組分）組成，表示為PolyGelTa。還制備了具有相同幾何形狀但沒有鉭NP的相同支架(PolyGel)。復(fù)合支架的制備根據(jù)實驗部分中報道的程序進(jìn)行。簡而言之，它包括(I)將電紡墊放置在從含有鉭NPs(明膠-鉭分散體)的明膠/京尼平溶液獲得的水凝膠層的表面上，(ii)在42℃下將第二層明膠-鉭分散體傾倒在電紡墊上，(iii)將獲得的材料在4℃下儲存24小時。 電紡氈的形態(tài)學(xué)分析顯示，濃度為5%、10%和20% (w/w)的PEG的存在沒有顯著影響纖維直徑(PLGA/PEG0為(0.91±0.16)μm，PLGA/PEG5為(1.16±0.22)μm，PLGA/PEG10為(1.28±0.21)μm，PLGA/PEG20為(1.32±0.20)μm)，并且所有的墊都顯示出多孔結(jié)構(gòu)以及光滑和無珠的隨機(jī)取向纖維。通過熱重分析(TGA)進(jìn)一步證實了PEG的存在，這使得能夠根據(jù)約350℃下的重量變化來定量PEG的量，歸因于PEG鏈降解  LGA/聚乙二醇20為13重量%，PLGA/聚乙二醇10為7重量%，PLGA/聚乙二醇5為4重量%，與飼料相當(dāng)接近。通過使用PLGA/PEG0纖維制造的PolyGelTa的橫截面視圖顯示水凝膠對墊的浸漬差，從而證實了相關(guān)發(fā)現(xiàn)。 層析分析強(qiáng)調(diào)了在PolyGelTa水凝膠層的整個厚度和表面上存在良好分散的鉭NP，缺乏與化學(xué)物質(zhì)一致的相關(guān)骨料（通過EDS進(jìn)行表征）。此外，分析的分布沿著水凝膠層厚度的納米顆粒證明它們是良好的分布，突出了水凝膠防止它們聚集的有效性。這一結(jié)果可以通過明膠鏈穩(wěn)定鉭納米顆粒的靜電相互作用來解釋。事實上，這項工作中使用的A型明膠的等電點pH值為8.4，意味著生物聚合物在復(fù)合制劑條件下帶正電(測量的pH= 7.2)，而鉭NP在該pH值下可能帶負(fù)電荷。由于鉭納米顆粒的存在，與PolyGel相比，PolyGelTa觀察到明顯更高的粗糙度，這可以排除聚集體的存在（典型的供應(yīng)鉭NPs特征）。粗糙度已被記錄為顯著影響細(xì)胞行為和性能：細(xì)胞優(yōu)先在粗糙表面上粘附、擴(kuò)散、遷移和增殖，優(yōu)于光滑表面�？紤]到這一點，含鉭納米顆粒的復(fù)合支架應(yīng)該代表骨細(xì)胞居住和功能以及骨基質(zhì)形成的更好環(huán)境。 PolyGel和PolyGelTa在PB中的膨脹和明膠釋放曲線結(jié)果顯示了相關(guān)的溶脹特性和明膠釋放規(guī)律。 由于新的復(fù)合支架是為骨組織接觸而設(shè)計的，因此MG63成骨細(xì)胞樣細(xì)胞系用于細(xì)胞毒性試驗。通過測量細(xì)胞活力和乳酸脫氫酶(LDH)釋放來進(jìn)行細(xì)胞毒性的定量評估。細(xì)胞生存力被認(rèn)為是評估的基本參數(shù)，因為生存力降低超過30%被認(rèn)為是細(xì)胞毒性效應(yīng)。培養(yǎng)3天后的細(xì)胞生存力結(jié)果顯示PolyGel和PolyGelTa的值與CTR沒有差異。 為了研究PolyGel和PolyGelTa作為細(xì)胞生長和維持分化的支持物的能力，在驗證了骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)向成骨細(xì)胞譜系分化的能力后，選擇了它們。細(xì)胞培養(yǎng)分別通過活/死以及茜素紅染色，比較基礎(chǔ)培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基的細(xì)胞生存力和礦化能力。兩種染色都證明了分化細(xì)胞和未分化細(xì)胞之間的差異，如形狀和方向以及鈣沉積。 為了研究支架在誘導(dǎo)和支持快速細(xì)胞建群中的潛力，在PolyGel和PolyGelTa上培養(yǎng)的hMSC的存活力和生物活性在培養(yǎng)的第3、7、10和14天進(jìn)行評估。將結(jié)果與分化培養(yǎng)(CTRd)和未分化培養(yǎng)(CTRnd)進(jìn)行比較。當(dāng)與CTRd(在每個實驗時間的PolyGel，在3、10和14天時的PolyGelTa)相比時，在生物材料上生長的hMSC顯示出較低的增殖，但是生存力的百分比總是超過70%，證實了不存在細(xì)胞毒性�；�/死染色也證明了hMSC粘附并生長在PolyGel和PolyGelTa樣品上，顯示了生物材料表面的規(guī)則形態(tài)和完全定殖，圖像與WST1值一致。 CTRd和CTRnd之間的比較表明，當(dāng)在合適的條件下培養(yǎng)時，hMSC能夠分化：除了在7天時BGLAP和CtSP7的值暫時較低之外，CTRd的所有實驗時間的所有研究參數(shù)的結(jié)果都較高，并且與CTRnd顯著不同。PolyGel、PolyGelTa和CTRd在培養(yǎng)14天的CTRnd的函數(shù)（認(rèn)為是1）結(jié)果顯示，所有觀察到的基因表達(dá)都被PolyGel培養(yǎng)物高度增強(qiáng)。 結(jié)論 在這項工作中，開發(fā)了一種創(chuàng)新的水凝膠/纖維納米復(fù)合材料支架，該支架在骨組織再生應(yīng)用中表現(xiàn)出令人感興趣的特性，如柔韌性、生物可降解性、生物相容性、仿生性和骨誘導(dǎo)性。 材料表征強(qiáng)調(diào)了纖維墊被水凝膠很好地浸漬，并且由于分散顆粒的存在，鉭NP的存在導(dǎo)致支架表面粗糙度的顯著增加，這在以前被報道對細(xì)胞粘附、遷移和增殖具有積極影響。隨著時間的推移，支架能夠保持其層狀結(jié)構(gòu)：事實上，在生理條件下六周后，沒有觀察到纖維墊和明膠水凝膠之間的分層。細(xì)胞毒性評估表明，PolyGel和PolyGelTa都允許細(xì)胞存活和擴(kuò)散，hMSC用于評估支架刺激其向成骨細(xì)胞譜系分化的潛力。 |
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