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我太秀了銅蟲 (小有名氣)
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干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)常見疑難全解析：核心坑點(diǎn)梳理與高效解決方案指南
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一、什么是干細(xì)胞？ 干細(xì)胞是一類具有“干性”的原始細(xì)胞，具有不斷復(fù)制的自我更新能力，以及分化為體內(nèi)多種功能細(xì)胞的潛能。根據(jù)分化能力的不同，干細(xì)胞大致可分為： 1.全能干細(xì)胞：具有發(fā)育為完整個(gè)體的潛能，如受精卵； 2.多能干細(xì)胞：能夠分化為幾乎所有的人體細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞（embryoinc stem cells, escs）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells, ipscs）； 3.專能干細(xì)胞：能夠分化為特定譜系類型的細(xì)胞。 在人類研究體系中，人多能干細(xì)胞（hpscs）因來源廣、倫理爭(zhēng)議小且可實(shí)現(xiàn)個(gè)性化制備，已成為科研與應(yīng)用中的理想模型。本文將以人多能干細(xì)胞為例子，帶大家梳理干細(xì)胞研究中如何將基因編輯與文庫(kù)篩選相結(jié)合，并解析其中的關(guān)鍵要點(diǎn)。 二、crispr/cas9系統(tǒng)在人多能干細(xì)胞上的應(yīng)用 crispr/cas9系統(tǒng)是目前最為常用于有效的基因編輯體系，不僅適用于個(gè)體與細(xì)胞的基因敲除、點(diǎn)突變或敲入等編輯操作，還能應(yīng)用于大規(guī)模的文庫(kù)篩選，尋找未知功能靶點(diǎn)。 人多能干細(xì)胞與crispr/cas9系統(tǒng)相結(jié)合，可廣泛應(yīng)用于： 1.多能性維持和早期胚胎發(fā)育的調(diào)控機(jī)制研究 2.疾病機(jī)制探索和藥物開發(fā) 3.功能細(xì)胞的工程化改造 4.細(xì)胞個(gè)性化治療 5.基于干細(xì)胞體系的crispr篩選 三、干細(xì)胞的基因編輯難點(diǎn) 盡管人多能干細(xì)胞（hpscs）已在 crispr/cas9 體系中廣泛應(yīng)用，但由于其生物學(xué)特性和培養(yǎng)體系的特殊要求，相較于常用細(xì)胞系，hpscs 的常規(guī)基因編輯仍面臨較高的技術(shù)門檻，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面： 1.細(xì)胞品系和培養(yǎng)條件需嚴(yán)格調(diào)控； 人多能干細(xì)胞相對(duì)比較脆弱，細(xì)胞狀態(tài)和多能性容易受到培養(yǎng)基成分、基質(zhì)條件、操作環(huán)境等因素的影響，因此對(duì)培養(yǎng)體系的穩(wěn)定性要求極高。 2.常用的轉(zhuǎn)染方法在人多能干細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染效率極低； 目前廣泛應(yīng)用的化學(xué)轉(zhuǎn)染方法如lipo3000、pei法等均無法真正有效地實(shí)現(xiàn)在人多能干細(xì)胞中的有效轉(zhuǎn)染。 3.人多能干細(xì)胞在單克隆培養(yǎng)上存在存活低以及多能性無法維持等問題； a.目前常用的單克隆挑取方法多需脫離超凈臺(tái)操作，存在一定污染風(fēng)險(xiǎn)； b.人多能干細(xì)胞在進(jìn)行單克隆形成時(shí)存在死亡率高、且極易存現(xiàn)多能性退出、自發(fā)分化以及遺傳不穩(wěn)定等問題。 四、干細(xì)胞crispr篩選的技術(shù)難點(diǎn)與破解思路 在干細(xì)胞研究中，如需開展大規(guī)模、無偏向的基因功能解析，crispr 文庫(kù)篩選是必不可少的工具。整體流程與常規(guī)文庫(kù)篩選相似，包括 sgrna 設(shè)計(jì)與合成、文庫(kù)構(gòu)建與病毒包裝、文庫(kù)cell pool構(gòu)建、功能性篩選以及數(shù)據(jù)分析 等環(huán)節(jié)。 然而，由于干細(xì)胞獨(dú)特的生物學(xué)屬性及對(duì)培養(yǎng)體系的高度依賴，在構(gòu)建干細(xì)胞文庫(kù)篩選平臺(tái)時(shí)仍面臨若干關(guān)鍵技術(shù)挑戰(zhàn)，仍需要特別關(guān)注。 1.感染細(xì)胞的選擇； 不同種類的干細(xì)胞，對(duì)應(yīng)著不同的研究體系和目的。而人多能干細(xì)胞（esc/ipsc），具有長(zhǎng)期增殖和維持能力，病毒感染相對(duì)于分化后的細(xì)胞更加容易，文庫(kù)cell pool構(gòu)建成功率高，是目前使用最多的類型，效果穩(wěn)定，最為推薦； 2.細(xì)胞干性的維持； 干細(xì)胞文庫(kù)構(gòu)建的另一個(gè)關(guān)鍵要點(diǎn)，就是細(xì)胞干性的維持。人多能干細(xì)胞的文庫(kù)cell pool的培養(yǎng)和編輯規(guī)模都非常大，要保證其文庫(kù)cell pool的成功構(gòu)建，除了在操作上的精細(xì)程度進(jìn)一步提高之外，還需要使用到利用 可誘導(dǎo)表達(dá)（tet-on）系統(tǒng)調(diào)控cas9 表達(dá)時(shí)序性的人多能干細(xì)胞系�？烧T導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的使用，不僅可以保證干細(xì)胞的文庫(kù)cell pool構(gòu)建過程中避免受到多能性相關(guān)基因被干預(yù)而造成的多能性推出問題，還能在不同階段個(gè)性化控制文庫(kù)篩選的啟動(dòng)，滿足客戶不同研究體系的需求，提高干細(xì)胞文庫(kù)篩選的靈活度。 3.適用的分化方法； a.在crispr篩選中，干細(xì)胞的分化體系是一個(gè)非常有效的功能篩選方式，但并非所有的分化方法都是適用于crispr篩選的。在分化方法上，推薦僅需要通過換液和整體傳代的方式的分化方法，而一些可能因?yàn)槿藶榛蛑饔^性操作造成局部細(xì)胞轉(zhuǎn)移的，如挑克隆、不均勻的傳代方式，均不適用于文庫(kù)篩選，分析會(huì)造成比較大的誤差。 五、干細(xì)胞定向分化 無論是基因編輯后的下游研究，還是文庫(kù) cell pool 的功能篩選，定向分化 都是干細(xì)胞研究流程中不可缺少的關(guān)鍵步驟。然而，不同分化路線在方法與難度上差異顯著，而體外定向分化普遍還面臨以下共性挑戰(zhàn)： 1.效率與純度相對(duì)較低； 2.功能成熟度不足； 3.信號(hào)通路調(diào)控復(fù)雜度高； 4.規(guī)�；c成本相對(duì)較高。 針對(duì)干細(xì)胞定向分化的技術(shù)難點(diǎn)，源井生物已開發(fā)出多樣化的干細(xì)胞定向分化平臺(tái)。在現(xiàn)有的干細(xì)胞培養(yǎng)體系和 ipsc 相關(guān)技術(shù)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步擴(kuò)展了神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞分化、前腦神經(jīng)元分化以及心肌分化等方面的技術(shù)服務(wù)，同時(shí)也涵蓋了早期三胚層分化、定向內(nèi)胚層分化、以及 心肌分化試劑盒 等三款定向分化相關(guān)產(chǎn)品，為干細(xì)胞基因編輯后的下游定向分化研究提供了完整的技術(shù)支撐。 |
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