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畢合生物2024銅蟲 (小有名氣)
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細(xì)胞周期和ROS數(shù)據(jù)圖分析
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1 什么是流式直方圖 流式直方圖是流式細(xì)胞術(shù)中最基本的單參數(shù)數(shù)據(jù)展示形式，它反映的是單個參數(shù)在整個細(xì)胞群中的分布情況。比如，這群細(xì)胞的大小。 下圖，橫坐標(biāo)（X軸）代表熒光信號或散射光信號的強(qiáng)度，從左到右信號逐漸增強(qiáng)。縱坐標(biāo)（Y軸）代表檢測到的細(xì)胞數(shù)量，通常用事件數(shù)目表示。 當(dāng)流式細(xì)胞儀檢測到一個細(xì)胞時(shí)，就記錄為一個事件（event），這個細(xì)胞的熒光強(qiáng)度決定它在X軸上的位置。比如，下圖，熒光強(qiáng)度弱的細(xì)胞會落在X軸左側(cè)，反之在右側(cè)。 如果大量細(xì)胞具有相似的熒光強(qiáng)度，就會在對應(yīng)位置形成峰。峰代表具有相似信號強(qiáng)度的細(xì)胞群體，峰的位置反映信號強(qiáng)弱，峰的高度反映該群體細(xì)胞的多少。 流式直方圖本質(zhì)上是一種統(tǒng)計(jì)直方圖，當(dāng)統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞數(shù)量足夠大時(shí)，原本的柱狀圖形會變成平滑的曲線。 接下來我們以幾個經(jīng)典實(shí)驗(yàn)應(yīng)用去詳細(xì)解析流式直方圖。 2 ROS（活性氧）水平檢測 活性氧是細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物，它的水平升高與細(xì)胞氧化應(yīng)激密切相關(guān)。 流式細(xì)胞術(shù)采用熒光探針（如DCFH-DA）檢測ROS水平。DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由進(jìn)入細(xì)胞。 細(xì)胞內(nèi)酯酶將其水解為DCFH，DCFH被ROS氧化為有熒光的DCF，熒光強(qiáng)度與ROS水平成正比。 下面這張數(shù)據(jù)圖，作者通過檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，評估Tempol處理是否能抑制順鉑誘導(dǎo)的ROS水平升高。 下圖顯示了四組細(xì)胞的ROS水平，X軸為FL1通道的熒光強(qiáng)度，與ROS水平成正比；Y軸為細(xì)胞數(shù)量。 每種顏色的曲線分別代表不同處理組，黑色曲線為未處理的對照組，紅色曲線為順鉑處理組，藍(lán)色曲線為Tempol處理組，綠色曲線為順鉑+Tempol處理組。 根據(jù)曲線位置可以得知： 未處理組（黑色）和Tempol處理組（藍(lán)色）的ROS水平基本一致，處于較低水平（X軸位置靠左，熒光強(qiáng)度較低）。 順鉑處理組（紅色）的ROS水平最高（X軸位置最右，熒光強(qiáng)度最強(qiáng)），說明順鉑處理后細(xì)胞的氧化應(yīng)激程度最高，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。 順鉑+Tempol處理組（綠色）的ROS水平比單純順鉑處理組有所降低（X軸位置比順鉑組靠左，熒光強(qiáng)度減弱），說明順鉑+Tempol處理可以顯著降低順鉑誘導(dǎo)的ROS水平升高。 3 細(xì)胞周期檢測 細(xì)胞周期分析也是流式直方圖的經(jīng)典應(yīng)用之一。 它的檢測原理基于細(xì)胞周期各時(shí)相DNA含量不同：G0/G1期具有二倍體DNA含量（2N），G2/M期具有四倍體DNA含量（4N），S期DNA含量介于二者之間。 下面這張圖利用流式細(xì)胞術(shù)分析了對照組細(xì)胞與劃痕后12小時(shí)修復(fù)細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。 X軸為DNA染料的熒光強(qiáng)度，反映DNA含量，而因?yàn)镈NA含量是連續(xù)倍數(shù)的關(guān)系（2N、4N），所以我們X軸必須用線性坐標(biāo)（lin）來顯示。Y軸為細(xì)胞數(shù)目，峰越高，代表處于該DNA含量的細(xì)胞數(shù)目越多。 從圖可以得知： 左側(cè)最高且最窄的峰（紅色），代表DNA含量為二倍體（2N）的細(xì)胞，包含G0期和G1期細(xì)胞。 右側(cè)矮峰（藍(lán)色），熒光強(qiáng)度是G0/G1峰的2倍（X軸數(shù)值是G0/G1峰數(shù)值的2倍），代表DNA含量為四倍體（4N）的細(xì)胞，包含G2期和M期細(xì)胞。 連接兩個峰之間的“平臺”（斜線），代表DNA含量從2N向4N過渡的細(xì)胞，也就是S期細(xì)胞。這個區(qū)域是一個連續(xù)分布，沒有明顯的峰，需要通過軟件（如ModFit）擬合計(jì)算細(xì)胞比例。 左右兩張圖對比，修復(fù)細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比例降低，而S期和G2/M期細(xì)胞比例增加，表明修復(fù)細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生了從G0/G1期向S期和G2/M期的轉(zhuǎn)變。 4 CFSE增殖檢測 CFSE（羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯）染色法是一種檢測細(xì)胞分裂的有效方法。 CFSE是一種可透過細(xì)胞膜的熒光染料，CFSE的前體CFDA-SE本身不發(fā)熒光，但進(jìn)入細(xì)胞后，其乙酸基團(tuán)會被細(xì)胞內(nèi)酯酶去除，從而使生成的CFSE分子具有熒光性。 CFSE又與細(xì)胞內(nèi)蛋白共價(jià)結(jié)合，細(xì)胞分裂時(shí)CFSE平均分配到子代細(xì)胞中，熒光強(qiáng)度減半，從而評估細(xì)胞分裂的次數(shù)。 下圖是圈選小鼠體內(nèi)CD45.1+/CD8+細(xì)胞進(jìn)行CFSE分析的數(shù)據(jù)圖。 在右側(cè)的CFSE增殖曲線中，X軸為CFSE的熒光強(qiáng)度，Y軸這里作者用最大百分比（%ofMax）代替了細(xì)胞數(shù)量，讓我們能夠更容易到觀察峰形的變化。 在右側(cè)直方圖中，我們可以看到： 最左側(cè)又高又寬的峰（深灰色）是未標(biāo)記CFSE的對照組，在X軸上呈現(xiàn)CFSE陰性(位于X軸左側(cè)）。 最右側(cè)又高又細(xì)的峰（淺灰色）是CFSE標(biāo)記但未刺激的實(shí)驗(yàn)組，在X軸上呈現(xiàn)CFSE熒光強(qiáng)度最強(qiáng)（位于X軸最右側(cè)）。由于未進(jìn)行刺激處理，所以細(xì)胞尚未發(fā)生增殖分裂，只有一個峰。 中間波浪形的曲線（黑色曲線）是CFSE標(biāo)記且刺激后的實(shí)驗(yàn)組，呈現(xiàn)出連續(xù)的、波浪型的多個峰，說明細(xì)胞發(fā)生了多次增殖分裂。 隨著細(xì)胞分裂，CFSE熒光染料被平均分配到兩個子細(xì)胞中，導(dǎo)致每個子細(xì)胞的熒光強(qiáng)度減半，圖中每個峰作者分別標(biāo)記了0、1、2......6： 0：未分裂的細(xì)胞，熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。 1：分裂一次的細(xì)胞，熒光強(qiáng)度為父代（0）的一半。 2：分裂兩次的細(xì)胞，熒光強(qiáng)度為“1”的一半，“0”的四分之一。 以此類推，可以得知圖上CFSE標(biāo)記的刺激組細(xì)胞分裂了六次。 畢合生物(www.bihebio.com)提供服務(wù)內(nèi)容：分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細(xì)胞資源庫與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
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