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仿生蠶絲蛋白修飾，開發(fā)出具有卓越機(jī)械性能和長期生物分子穩(wěn)定性的即時(shí)可溶解微針
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一、 背景 從蠶絲蛋白中獲得的可溶解微針 （DMN） 被認(rèn)為是最有前途的，因?yàn)樗鼈兊男Q絲基質(zhì)具有生物相容性、可調(diào)節(jié)的機(jī)械性能和卓越的生物分子穩(wěn)定性能，這是治療性生物分子和疫苗的無冷鏈儲(chǔ)存和運(yùn)輸所必需的。然而，具有優(yōu)異機(jī)械性能和出色儲(chǔ)存穩(wěn)定性（在 4 °C 和 25 °C 下）的絲基速溶微針 （DMN） 的需求尚未得到滿足。本文首次通過在絲素蛋白分子中引入羧基來限制它們的分子內(nèi)和分子間相互作用、構(gòu)象變化和在更高濃度下形成β片，從而改善絲素蛋白的溶解度，從而應(yīng)對這些挑戰(zhàn)。這種在改性絲 （MS） 中富集羧基的仿生方法通過限制其卷曲到β片轉(zhuǎn)化，可實(shí)現(xiàn) >10% 至 25% w/v 的更高溶解度。此外，它還允許制備具有更高濃度的MS（>10% w/v至20% w/v）和穩(wěn)定劑（>5% w/v）但具有優(yōu)異的機(jī)械性能（>0.4 N）和基質(zhì)中生物分子的穩(wěn)定性的蠶絲DMN。在不同溫度下長期儲(chǔ)存，MS-DMN的瞬間溶解性也不受影響。 二、 研究內(nèi)容 在這項(xiàng)研究中，我們首次通過對絲素蛋白分子進(jìn)行羧基修飾來限制其分子間和分子內(nèi)相互作用，從而通過低粘度增強(qiáng)其溶解度來阻礙卷β片的形成。與UMS相比，改性絲（MS）有助于制備穩(wěn)定劑濃度超過10% w/v的MS-DMN和MS-T-DMN，如圖1所示。不同MS及UMS樣品的核磁共振譜圖，證實(shí)絲綢經(jīng)羧基修飾。UMS與MS的FTIR光譜，表明絲綢的羧基修飾通過降低分子間作用力阻礙了卷曲-螺旋相變。UMS與MS的SDS凝膠電泳圖譜顯示，MS因引入羧基與SDS產(chǎn)生靜電排斥作用，導(dǎo)致電泳遷移率降低。UMS的圓二色譜顯示222 nm處出現(xiàn)更高負(fù)峰（對應(yīng)β-片層），而MS在198 nm處出現(xiàn)負(fù)峰（對應(yīng)隨機(jī)卷曲/α-螺旋）。MS10、MS15、MS20及UMS10在室溫儲(chǔ)存90天后的溶解度變化：因卷曲-β片層相變導(dǎo)致凝膠化，但同等濃度的MS20仍保持液態(tài)。這種仿生改性方法有助于控制蠶絲蛋白中的線圈-β片轉(zhuǎn)變，這有利于制備具有高機(jī)械強(qiáng)度的微針。 圖1 絲素蛋白的修飾 選擇MS與穩(wěn)定劑（海藻糖、蔗糖）聯(lián)合作為基質(zhì)，制備MS穩(wěn)定劑（MS-T）復(fù)合微針，以穩(wěn)定生物分子。圖2 CD光譜顯示，MS-DMN在198 nm處具有較高的負(fù)峰，對應(yīng)于無規(guī)則線圈/α螺旋，而UMS4.5-DMN在222 nm處顯示較高的負(fù)峰，對應(yīng)于β片。MS20-DMN的CD光譜包含不同的穩(wěn)定劑濃度（5%、7.5%、10% w/v），在198 nm處顯示出較高的負(fù)峰，表明存在隨機(jī)卷曲/α螺旋。UMS中游離氨基和羥基的羧基修飾可以通過抑制β片的形成來減少鏈間或鏈內(nèi)氫鍵，可能有助于MS-DMN在室溫下的儲(chǔ)存。 圖2 MS穩(wěn)定分子之間的分子相互作用 圖3表明，MS20-DMN、MS15-DMN、MS10-DMN和UMS4.5-DMN表現(xiàn)出快速溶解性，而UMS4.5-DMN-RT90在插入20%明膠凝膠中時(shí)不溶解。將MS-DMN和MS-T-DMN在室溫下儲(chǔ)存，MS-DMN在25 °C下儲(chǔ)存6個(gè)月后，在5 min內(nèi)仍保持完整的形態(tài)和溶解性，但UMS-DMN變脆且容易破損。研究了 SSD-MS-DMN 藥物的離體皮膚滲透性，并與 UMS-DMN 進(jìn)行了比較。不同比例的MS-DMN和UMS4.5-DMN在施用后5 min內(nèi)SSD的累積釋放量均超過100%。相比之下，UMS4.5-DMN-RT90在5 min內(nèi)分別低于15%，表明UMS4.5-DMN-RT90的二級結(jié)構(gòu)從隨機(jī)卷曲變?yōu)棣缕瑢?dǎo)致凝膠化，導(dǎo)致UMS4.5-DMN-RT90藥物釋放緩慢。 圖3 MS-DMN的物理形態(tài)、崩解和體外釋放 微針的機(jī)械堅(jiān)固性對于其成功滲透到皮膚中至關(guān)重要。DMN 中的水分會(huì)削弱其機(jī)械性能，并通過改變其蛋白質(zhì)構(gòu)象來減少其瞬間溶解，最終導(dǎo)致皮膚滲透性差。MS-DMN 能夠有效穿透皮膚并輸送有效載荷。然而，微針基質(zhì)中蛋白質(zhì)濃度越低或穩(wěn)定劑濃度越高，斷裂力越小。鑒于穩(wěn)定生物分子需要更高濃度的海藻糖，分析了海藻糖的百分比，發(fā)現(xiàn)即使在PRP-SSD-MS20-DMN中海藻糖的濃度增加5-10% w/v后，斷裂力也從每個(gè)貼片的82 N降低到48 N，并且將其濃度增加到10% w/v以上會(huì)導(dǎo)致微針在制造和處理后難以脫模。所有含有5%w/v海藻糖的MS-DMN制劑的豬皮穿透深度均超過300 μm，而UMS4.5-T5-DMN制劑的滲透深度僅為10 μm。 圖4 DMN的機(jī)械性能 載有穩(wěn)定劑的各種蠶絲DMN貼片的生物相容性如圖5所示，用各種微針對HEK293細(xì)胞進(jìn)行24和48小時(shí)的活死染色圖像，顯示所有MS-DMN組的細(xì)胞活力超過70%。HEK293細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白鬼筆環(huán)肽染色和DAPI與微針孵育24和48 h，表明所有MS-DMN組均顯示出完整的細(xì)胞形態(tài)。用MTT測定法定量分析與HEK293細(xì)胞孵育的各種微針的生物相容性，各組均無細(xì)胞毒性；溶血測定表明，所有樣品，無論MS-DMN中的海藻糖或SSD，都表現(xiàn)出最小的紅細(xì)胞死亡。 圖5 MS-DMN的生物相容性和生物安全性 本研究旨在通過與優(yōu)化的MS穩(wěn)定劑混合并在不同溫度下儲(chǔ)存，提高PRP/HRP作為加載在DMN中的模型生物分子的穩(wěn)定性，如圖6所示。當(dāng)在4°C下儲(chǔ)存一個(gè)月時(shí)，PRP-MS20-T5-MN組表現(xiàn)出超過80%的HRP活性，在25°C下儲(chǔ)存超過6個(gè)月時(shí)表現(xiàn)出70%的相對HRP活性（圖6A）。當(dāng)添加穩(wěn)定劑時(shí)，由于氫鍵和玻璃狀基質(zhì)形成的協(xié)同作用，HRP穩(wěn)定性進(jìn)一步提高。進(jìn)一步探索了使用另一種生物分子（PRP）的穩(wěn)定作用，并觀察到與HRP相似的生物活性保留模式。在25 °C下儲(chǔ)存6個(gè)月后釋放的PRP與未儲(chǔ)存的DMN無顯著差異，所有PRP-MS20-T5-DMN-（0,1,2,3,6）的增殖率均超過95%，優(yōu)于48 h內(nèi)58%的MS20-T5-DMN。 CAM 測定是幾種功能測定之一，為研究血管生成和轉(zhuǎn)移提供了一種易于使用且適應(yīng)性強(qiáng)的動(dòng)物模型。如圖6E所示，目前的工作使用卵內(nèi)CAM測定法評估了PRP在不同溫度下儲(chǔ)存6個(gè)月后在DMN中的生物活性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性。結(jié)果表明MS20-T5-DMN可以在4 °C和25 °C下維持PRP活性6個(gè)月。 圖6 MS-DMN中生物分子的儲(chǔ)存穩(wěn)定性以及卵細(xì)胞血管生成研究 具體來說，解決生物分子不穩(wěn)定性的方法包括加入更高濃度的穩(wěn)定劑，以降低生物分子在干燥或脫水過程中的遷移率。在40°C和75%相對濕度下儲(chǔ)存30天時(shí)，與5% w/v海藻糖（85%）相比，10%w/v海藻糖（95%）更好地保留了富血小板血漿（PRP）的生物活性（圖7）。 圖7 與在25 °C下儲(chǔ)存一個(gè)月的PRP負(fù)載MS20-T5-DMN相比，在40 °C、75%相對濕度下儲(chǔ)存PRP負(fù)載的MS20-T5-DMN的加速生物活性評估 使用糖尿病傷口愈合模型評估 SSD-PRP-MS20-T5-DMN （6 個(gè)月）處理和儲(chǔ)存應(yīng)激后 PRP 的生物活性。SSD-PRP-MS20-T5-DMN具有抗氧化劑SSD的瞬間釋放、沉積的ECM樣MS和PRP的獨(dú)特組合，有助于成纖維細(xì)胞募集和膠原沉積，促進(jìn)傷口愈合，因此顯示出更好的治療效果。 圖8 體內(nèi)研究 三、 總結(jié)與展望 使用>5% w/v的蠶絲和穩(wěn)定劑制備的傳統(tǒng)蠶絲微針依靠β片感應(yīng)賦予高機(jī)械強(qiáng)度來刺穿角質(zhì)層，但由于β片的疏水性質(zhì)而失去了即時(shí)溶解性�？傊�，我們報(bào)道了一種獨(dú)特的蠶絲修飾仿生方法（MS），模擬蠶絲蛋白（>20% w/v）儲(chǔ)存在味精管腔中，以在限制β片生長的情況下實(shí)現(xiàn)卓越的溶解度。制備的MS-DMN貼片顯示出瞬間溶解性和優(yōu)異的機(jī)械強(qiáng)度>45 N，超過了目前大多數(shù)可用的絲基DMN，而不會(huì)誘導(dǎo)β片的形成。此外，由于分子間/分子間相互作用減少，MS-DMN即使在25 °C下長期儲(chǔ)存后仍會(huì)崩解，而這在未修飾或天然的絲基DMN中難以控制。MS20-T5-DMN在4 °C和25 °C下保存6個(gè)月時(shí)，可保留70%以上的PRP和HRP活性，在較高溫度（40 °C、75% RH）下保存1個(gè)月，可保留90%以上的PRP和HRP活性。PRP的生物活性在MS-DMN中保留，并在體內(nèi)顯示出有效的傷口愈合率。這種仿生方法為制備具有高機(jī)械強(qiáng)度的絲基DMN提供了一種解決方案，而不會(huì)誘導(dǎo)β片形成，以及一個(gè)在室溫下穩(wěn)定生物分子的平臺(tái)。MS-DMN的初步評估表明，它在室溫下為PRP提供了更好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性6個(gè)月以上;因此，我們正在利用模型抗原將其在疫苗遞送應(yīng)用中的潛力轉(zhuǎn)化為可能。 原文鏈接：https://doi.org/10.1039/d4tb02836h |
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