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醫(yī)用蠶絲科技新蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
絲素蛋白/透明質(zhì)酸/脫礦質(zhì)牙本質(zhì)基質(zhì)混合水凝膠衍生的優(yōu)異牙槽骨移植替代物 已有1人參與
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研究背景： 骨移植替代材料常用于修復(fù)大面積骨缺損，而恢復(fù)牙槽骨缺損的高度和寬度是牙科修復(fù)面臨的主要挑戰(zhàn)。與牛源骨粉、羥基磷灰石等臨床常用骨移植替代材料相比，脫礦質(zhì)牙本質(zhì)基質(zhì)（DDM）因其成分與人體骨骼相似，成為極具價(jià)值的替代方案。然而，DDM在骨修復(fù)中的應(yīng)用仍面臨挑戰(zhàn)，其顆粒形態(tài)難以維持空間形態(tài)。為此，浙江省人民醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心楊帆教授等人開(kāi)發(fā)了一種高效骨移植替代材料：將DDM顆粒嵌入快速固化的絲素蛋白/透明質(zhì)酸甲基丙烯酸酯（SF/HAMA）水凝膠中，該材料克服了傳統(tǒng)HA衍生水凝膠機(jī)械強(qiáng)度差的缺陷，能與牙槽骨缺損區(qū)緊密結(jié)合，并在藍(lán)光照射下快速凝膠化，在大鼠顱骨和犬下頜骨缺損模型中表現(xiàn)出優(yōu)異的再生修復(fù)能力。 圖1 復(fù)合骨移植替代物的制備及修復(fù)骨缺損的示意圖 研究?jī)?nèi)容： 圖2 SF/HAMA復(fù)合水凝膠的性能研究 1.SF/HA/DDM骨移植替代物的合成與表征：圖2A氫譜結(jié)果可以看出，與SF相比，SF-GSH在2.17、2.56、2.93和2.95 ppm處的特征峰表明GSH已成功與SF共價(jià)鍵合。其中，位于2.93和2.95 ppm的峰對(duì)應(yīng)GSH中連接到硫醇基團(tuán)的亞甲基，GSH的取代度為17.99%。在HAMA氫譜中可以看到微弱的衍射峰，出現(xiàn)在1.8ppm、5.6和6.1ppm，對(duì)應(yīng)于MA的特征峰，表明MA已成功接枝到HA主鏈上，經(jīng)計(jì)算MA的取代度為48%。 通過(guò)硫醇-烯點(diǎn)擊反應(yīng)制備SF/HAMA水凝膠，并在藍(lán)光下進(jìn)行快速交聯(lián)。如圖2B所示：通過(guò)調(diào)整HAMA與SF-GSH的質(zhì)量比，制備了交聯(lián)度可調(diào)的水凝膠，命名為SF-25(25%SF，75%HAMA)、SF-33(33%SF，67%HAMA)和SF-50(50%SF，50%HAMA)。圖2C的SEM和孔徑分布圖顯示，冷凍干燥后的SF/HAMA水凝膠都具有均勻、開(kāi)放的孔道結(jié)構(gòu)。考慮到高孔隙率和大孔徑對(duì)成骨能力的改善，因此選擇SF-25進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 觀察DDM的結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)牙本質(zhì)小管分布均勻，孔徑約為2 μm（圖2D）。DDM的物相分析光譜顯示脫礦后其主要成分為羥基磷灰石（圖2E）。SEM觀察表明，SF-25與DDM混合后，水凝膠保持了其多孔結(jié)構(gòu)，牙本質(zhì)小管和孔洞在DDM上均勻排列(圖2F)。如圖2G所示，壓縮彈性系數(shù)反映SF-25、SF-33和SF-50的機(jī)械強(qiáng)度分別為0.38、0.24和0.18 Mpa。而DDM添加量會(huì)導(dǎo)致壓縮強(qiáng)度降低，SF/HAMA/DDM-15、SF/HAMA/DDM-35和SF/HAMA/DDM50的抗壓強(qiáng)度分別為90、43和29 kPa(圖2H)。 SF/HAMA水凝膠在PBS中30分鐘內(nèi)達(dá)到溶脹平衡，溶脹速率約為30wt%(圖2I)，并在整個(gè)測(cè)試過(guò)程中保持其初始形狀，表明其物理和化學(xué)穩(wěn)定性適合作為骨移植替代品。此外，由于交聯(lián)大分子鏈的快速和突然斷裂而導(dǎo)致的不可控制的快速降解，是影響骨缺損的修復(fù)的主要原因。而圖2J表明SF/HAMA水凝膠的降解率可控，21天的降解率為17.34%，適合作為骨組織再生的骨移植替代物。 圖3 SF/HAMA復(fù)合水凝膠的生物相容性 2.生物相容性評(píng)價(jià)：將SF-25水凝膠與DDM粒子按15%、35%和50%的質(zhì)量比共混，制備了SF/HAMA/DDM復(fù)合材料。細(xì)胞活/死染色證實(shí)了復(fù)合水凝膠與細(xì)胞共培養(yǎng)后牙周膜干細(xì)胞能保持良好的活性（圖3A）。圖3B劃痕試驗(yàn)說(shuō)明SF/HAMA/DDM-35和SF/HAMA/DDM-50組表現(xiàn)出更強(qiáng)的遷移活性和促愈合能力。圖3D中的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，SF/HAMA在一定程度上可以促進(jìn)細(xì)胞遷移。此外，DDM的加入具有協(xié)同作用，進(jìn)一步促進(jìn)了劃痕愈合。CCK-8試驗(yàn)證明了水凝膠的低細(xì)胞毒性(圖3C)。進(jìn)而將該水凝膠植入大鼠背部皮下，1周后水凝膠被輕度降解，被纖維結(jié)締組織包裹。水凝膠大部分殘留在植入部位。與正常皮下組織相比，植入水凝膠組沒(méi)有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或急性炎癥反應(yīng)，也沒(méi)有對(duì)其他組織產(chǎn)生毒性反應(yīng)(圖3E-G)。 圖4 SF/HAMA復(fù)合水凝膠的促成骨能力 3.促成骨能力評(píng)價(jià)：評(píng)價(jià)骨移植生物材料性能的關(guān)鍵是確定其能否促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞與成骨細(xì)胞的成骨分化。圖4A為牙周膜干細(xì)胞在水凝膠滲濾液中培養(yǎng)4天和7天后堿性磷酸酶染色的顯微圖像。與空白組和SF/HAMA組相比，SF/HAMA/DDM組染色面積較大，陽(yáng)性面積隨DDM含量增加而擴(kuò)大，其中SF/HAMA/DDM-50組增加最為明顯。第21天牙周膜干細(xì)胞ARS染色顯示SF/HAMA/DDM-50和SF/HAMA/DDM-35組較對(duì)照組和低DDM組有更多的鈣沉積，其中SF/HAMA/DDM-50顯示最高的礦化效率。這些結(jié)果表明，SF/HAMA/DDM復(fù)合骨移植替代物是一種很有前途的骨組織再生材料。 圖4D和E顯示了復(fù)合材料在成骨過(guò)程中的基因表達(dá)。RUNX-2、ALP的表達(dá)與成骨細(xì)胞活性和成骨分化直接相關(guān)。圖中分別顯示了在4、7、14天的時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，SF/HAMA/DDM組相對(duì)于對(duì)照組RUNX-2表達(dá)上調(diào)，第7天時(shí)，ALP也顯著上升。此外，在第14天，SF/HAMA/DDM組I型膠原水平明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明其促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附和發(fā)育，有助于骨的維護(hù)和修復(fù)。研究表明，骨鈣素(OCN)是骨礦化階段的標(biāo)志，并可在成熟的成骨細(xì)胞中表達(dá)。在第14天，OCN、OPN（骨橋蛋白）的表達(dá)明顯增加，這與骨組織礦化的增強(qiáng)相一致。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明，與其他組相比，骨移植替代物SF/HAMA/DDM可以促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的增殖和成骨分化。 圖5 大鼠顱骨缺損的修復(fù)實(shí)驗(yàn) 4.復(fù)合骨移植替代物體內(nèi)修復(fù)大段骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究（大鼠）：將骨移植替代物植入大鼠顱骨缺損區(qū)觀察8周和16周，隨后并取材進(jìn)行CT掃描。圖5A中空白組和DDM組未見(jiàn)明顯的缺損區(qū)縮小趨勢(shì)，僅在缺損區(qū)邊緣有少量新骨形成。SF/HAMA/DDM-35組和SF/HAMA/DDM-50組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有較好的成骨效果，明顯減少了大鼠顱骨缺損的面積。16周后，SF/HAMA/DDM-50組完全骨化，新生骨組織幾乎完全覆蓋缺損區(qū)。圖5B~D顯示SF/HAMA/DDM-35組和SF/HAMA/DDM-50組BV/Tv（新生骨量）、Tb.Th（骨小梁厚度）增加、Tb.sp（骨小梁分離度）降低，與空白組和DDM組比較有顯著差異。 圖6 大鼠顱骨缺損修復(fù)的組織學(xué)觀察 用H&E和Masson染色檢測(cè)SF/HAMA/DDM復(fù)合材料在植入大鼠顱骨缺損處后8周、16周的成骨潛能。各組骨缺損處均有纖維結(jié)締組織填充，內(nèi)含成纖維細(xì)胞和血管，空白組骨缺損處未見(jiàn)明顯新骨形成，DDM組的DDM顆粒被纖維組織包裹，缺損區(qū)邊緣僅見(jiàn)少量新骨形成。與空白組和陰性對(duì)照組相比，SF/HAMA/DDM-50和SF/HAMA/DDM-35組有更多的新骨形成，明顯縮短了雙側(cè)骨缺損的距離。術(shù)后16周，空白組缺損處新骨仍較少，缺損處仍有大量纖維結(jié)締組織填充。DDM組術(shù)后8周新生骨較多，未成熟編織骨與成熟骨小梁混雜，DDM顆粒部分吸收，但缺損區(qū)仍可見(jiàn)較多纖維結(jié)締組織。16周時(shí)SF/HAMA/DDM-35和SF/HAMA/DDM-50組基本完全愈合，缺損區(qū)被骨組織替代，骨組織內(nèi)可見(jiàn)血管，骨組織上覆蓋纖維結(jié)締組織。 圖7 比格犬下頜骨缺損的骨修復(fù)實(shí)驗(yàn) 5.復(fù)合骨移植替代物體內(nèi)修復(fù)大段骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究（比格犬）：將骨移植替代物植入Beagle犬下頜骨缺損區(qū)4周和8周。術(shù)后4周的Micro-CT三維重建結(jié)果顯示，各組骨缺損處均可見(jiàn)新生骨組織，但空白組有明顯的缺損區(qū)，其余各組骨缺損區(qū)均可見(jiàn)DDM填充。8周后，空白組的缺損區(qū)較修復(fù)前縮小，但仍相對(duì)空洞。SF/HAMA/DDM-35組和SF/HAMA/DDM-50組的DDM部分被吸收，成骨更明顯，缺損區(qū)有新骨填充。如圖7B-D所示，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，SF/HAMA/DDM-35和SF/HAMA/DDM-50組的BV/TV和Tb.Th均顯著高于空白組和DDM組。SF/HAMA/DDM-50組的Tb.Sp最低，表明該組的新骨具有最高的骨密度。 圖8 比格犬下頜骨缺損修復(fù)的組織學(xué)檢測(cè) 通過(guò)H&E、Masson和Goldner染色，評(píng)價(jià)了SF/HAMA/DDM復(fù)合骨移植替代物修復(fù)比格犬下頜骨缺損的能力。如圖8所示，在術(shù)后4周和8周，所有標(biāo)本的缺損區(qū)均有新骨形成。大體觀察結(jié)果如下：對(duì)照組在第4周時(shí)可見(jiàn)編織骨，8周時(shí)皮質(zhì)板層骨較多，下頜骨體積明顯不足。4周時(shí)SF/HAMA/DDM-35和SF/HAMA/DDM-50組以編織骨為主，8周時(shí)兩組在再生區(qū)顆粒間可見(jiàn)較成熟的骨。上述結(jié)果表明，當(dāng)DDM摻雜到水凝膠中時(shí)，可以更有效地誘導(dǎo)骨再生。 結(jié)論： 本研究開(kāi)發(fā)了一種多功能水凝膠復(fù)合材料：SF/HAMA/DDM作為骨移植替代品，生物安全性和體內(nèi)結(jié)果證實(shí)了其良好的骨再生能力，將DDM摻雜到水凝膠中時(shí)，可以更有效地誘導(dǎo)骨再生。SF/HAMA/DDM在修復(fù)細(xì)胞和動(dòng)物水平的骨缺損方面具有良好的應(yīng)用前景，可以作為大規(guī)模骨組織再生的有效替代材料。 原文鏈接： https://doi.org/10.34133/bmr.0243 |
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