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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 生物科學 » 綜合其他 » 質粒轉染的詳細步驟
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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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質粒轉染的詳細步驟
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細胞轉染是指將外源核酸（如 DNA、RNA、siRNA 等）導入真核細胞內的技術，目的是讓外源核酸在細胞中表達、復制或發(fā)揮特定功能（如基因編輯、基因沉默等）前幾期內容中我們減少了瞬時轉染與穩(wěn)定轉染以及不同細胞的轉染效率差異等，今天我們介紹一下質粒轉染的步驟，主要以賽默飛的lipo3000為例子。01 實驗前準備 1.質粒 DNA（純度高，A260/A280 比值 1.8-2.0左右）◦2.Lipofectamine 3000 試劑3.P3000™試劑（轉染增強劑，與 Lipofectamine 3000 配套使用）4. Opti-MEM™ I 減血清培養(yǎng)基（用于稀釋質粒和轉染試劑）5.處于對數(shù)生長期的目標細胞（轉染前 24 小時接種，確保轉染時匯合度達 70%-90%）；6. 培養(yǎng)基02 具體實驗步驟 一.細胞接種培養(yǎng): 轉染當天細胞匯合度控制在60%-80%較好二、轉染操作步驟1. 制備 DNA - 轉染試劑復合物稀釋 DNA：取一無菌離心管A，加入 125μL Opti-MEM™培養(yǎng)基，加入 2.5μg 質粒 DNA，輕輕混勻后加入 5μL P3000™試劑，吹吸混勻（P3000 與 DNA 比例保持 1:0.5，確保結合效率）靜置5min。稀釋 Lipofectamine 3000：另取一離心管B，加入 125μL Opti-MEM™培養(yǎng)基，加入 5μL Lipofectamine 3000 試劑，輕輕混勻后室溫靜置 5 分鐘。形成復合物：將 DNA-P3000 混合液緩慢加入 Lipofectamine 3000 稀釋液中，輕輕混勻，室溫靜置 15 分鐘。2. 細胞轉染棄去6孔板原有培養(yǎng)基，每孔加入1.8mL培養(yǎng)基（不添加雙抗），每孔緩慢加入 250μL復合物，輕輕晃動培養(yǎng)板使均勻分布，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3. 后續(xù)處理轉染后 4-6 小時：若細胞狀態(tài)良好，可不必更換培養(yǎng)基；若出現(xiàn)輕微漂浮，更換為 2mL 新鮮完全培養(yǎng)基轉染后 24-48 小時：檢測轉染效率（如熒光蛋白表達），48-72 小時檢測目的基因表達。 |
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