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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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細(xì)胞動(dòng)不動(dòng)一下就「長(zhǎng)滿」！原來是沒有學(xué)會(huì)它！
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細(xì)胞計(jì)數(shù)是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的一項(xiàng)基本功，遙想當(dāng)年，剛進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室做細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，最讓大家頭疼的就是給細(xì)胞計(jì)數(shù)了，雖然比較簡(jiǎn)單，但是經(jīng)常暈頭轉(zhuǎn)向、數(shù)到眼瞎，且一個(gè)不小心被其他人打斷了思路，分分鐘前功盡棄。細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法有很多種，最常見也是最直接的方法有血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、電子計(jì)數(shù)儀、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)等。還有一些間接判斷細(xì)胞數(shù)量的方法，如結(jié)晶紫染色、MTT分析等。 01計(jì)數(shù)板準(zhǔn)備 使用雙蒸水或者70%-75%乙醇，將蓋玻片和細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行清潔晾干備用。再將晾干的蓋玻片輕輕覆蓋至血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，放在顯微鏡下，觀察計(jì)數(shù)格位置是否是潔凈的。 值得注意的是，使用前須保證蓋玻片和計(jì)數(shù)板已充分晾干，否則將影響后續(xù)細(xì)胞充池及計(jì)數(shù)結(jié)果；一般使用乙醇清潔比較多，乙醇可快速揮發(fā)，干燥比較快；如需要擦拭，最好使用擦鏡紙擦拭。 02制備細(xì)胞懸液 樣本制備是細(xì)胞計(jì)數(shù)的第一步，也是至關(guān)重要的一步。細(xì)胞的活性和分散程度直接影響計(jì)數(shù)結(jié)果，如果細(xì)胞懸液制備不當(dāng)，出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)聚或沉淀，就會(huì)導(dǎo)致計(jì)數(shù)時(shí)重復(fù)計(jì)數(shù)或漏計(jì)，從而使結(jié)果不準(zhǔn)確。例如在制備腫瘤細(xì)胞懸液時(shí)，需要使用適當(dāng)?shù)南笇⒓?xì)胞從組織塊中分離出來，消化時(shí)間過長(zhǎng)或過短都會(huì)影響細(xì)胞的活性和分散效果。消化時(shí)間過長(zhǎng)，細(xì)胞會(huì)被過度消化，導(dǎo)致細(xì)胞膜破損，細(xì)胞死亡；消化時(shí)間過短，細(xì)胞則無法充分分離，容易形成團(tuán)塊。 對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，我們需要首先使用胰酶消化的方法使細(xì)胞從培養(yǎng)皿表面脫落，并加入適當(dāng)?shù)暮迮囵B(yǎng)基，中和胰酶的作用并重懸細(xì)胞，以得到均質(zhì)的細(xì)胞懸液。并稀釋到合適的倍數(shù)。如果需要計(jì)算細(xì)胞的活率，則需要將細(xì)胞懸液和0.4%臺(tái)盼藍(lán)等體積混合;室溫孵育3~5分鐘，使臺(tái)盼蘭完全進(jìn)入死細(xì)胞，使死細(xì)胞著藍(lán)色(注: 懸浮細(xì)胞染色時(shí)間可視情況適當(dāng)延長(zhǎng))。 03血細(xì)胞計(jì)數(shù)板加樣 充池是將細(xì)胞懸液引入計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)區(qū)域的過程。這一步驟要求操作輕柔、迅速，避免產(chǎn)生氣泡，氣泡的存在會(huì)占據(jù)計(jì)數(shù)區(qū)域的空間，干擾細(xì)胞的觀察和計(jì)數(shù)。同時(shí)，充池后要等待細(xì)胞沉降一段時(shí)間，使細(xì)胞均勻分布在計(jì)數(shù)區(qū)域內(nèi)，再進(jìn)行計(jì)數(shù)，如果過早計(jì)數(shù)，細(xì)胞可能還未完全沉降，會(huì)導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果偏低；如果等待時(shí)間過長(zhǎng)，細(xì)胞可能會(huì)因干燥或死亡而影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。 值得注意的是，若需進(jìn)行多個(gè)樣品的計(jì)數(shù)，應(yīng)盡量保證每次充池的體積一致一般在10 μL/池左右，如果計(jì)數(shù)數(shù)內(nèi)未充滿細(xì)胞，或者過多都將影響計(jì)數(shù)結(jié)果；操作時(shí)，蓋玻片下不能有氣泡，也不能使細(xì)胞懸液流入另一個(gè)樣品池中，否則需要重新清洗計(jì)數(shù)板重新加樣計(jì)數(shù)。 04 細(xì)胞計(jì)數(shù) 在顯微鏡下觀察細(xì)胞時(shí)，要選擇合適的放大倍數(shù)和光線強(qiáng)度，以確保能夠清晰地看到細(xì)胞。計(jì)數(shù)時(shí)，要遵循一定的計(jì)數(shù)規(guī)則，如“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”，避免重復(fù)計(jì)數(shù)或漏計(jì)。此外，對(duì)于形態(tài)不規(guī)則或難以辨認(rèn)的細(xì)胞，要結(jié)合細(xì)胞的特征和經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行準(zhǔn)確判斷。例如在計(jì)數(shù)白細(xì)胞時(shí)，要根據(jù)細(xì)胞的核形態(tài)和細(xì)胞質(zhì)的特點(diǎn)區(qū)分不同類型的白細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等。 05細(xì)胞濃度計(jì)算 由下圖可以得出，每個(gè)大方格的容積為: 1mm2 × 0.1mm=0.1mm3=10-4cm3= 10-4mL，在常規(guī)沒有使用臺(tái)盼藍(lán)染色時(shí)，可以以下面公式計(jì)算每毫升樣品中細(xì)胞的個(gè)數(shù): 每毫升樣品中細(xì)胞的個(gè)數(shù)=每個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞的平均數(shù) x細(xì)胞稀釋倍數(shù)x104。 06影響細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果的因素 1. 細(xì)胞類型與狀態(tài)不同類型的細(xì)胞具有不同的形態(tài)和大小，其計(jì)數(shù)方法也可能有所差異。例如紅細(xì)胞體積較小，數(shù)量眾多，計(jì)數(shù)時(shí)需要采用特定的稀釋倍數(shù)和計(jì)數(shù)方法；而白細(xì)胞體積較大，數(shù)量相對(duì)較少，計(jì)數(shù)時(shí)需要更加仔細(xì)地觀察和區(qū)分。此外，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)也會(huì)影響計(jì)數(shù)結(jié)果。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞活性高、分散性好，計(jì)數(shù)結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確；而處于衰老期或凋亡期的細(xì)胞則容易出現(xiàn)團(tuán)聚或變形，影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。2. 環(huán)境因素環(huán)境溫度、濕度和pH值等因素也會(huì)對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)產(chǎn)生影響。溫度過高或過低會(huì)影響細(xì)胞的活性和代謝，導(dǎo)致細(xì)胞死亡或變形；濕度過低會(huì)使細(xì)胞懸液蒸發(fā)，導(dǎo)致細(xì)胞濃度升高；pH值的變化會(huì)影響細(xì)胞的電荷分布和分散狀態(tài)，從而影響計(jì)數(shù)結(jié)果。因此，在進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要盡量保持環(huán)境條件的穩(wěn)定，為細(xì)胞提供一個(gè)適宜的生存環(huán)境。 |
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