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我太秀了銅蟲 (小有名氣)
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CRISPR篩選發(fā)現(xiàn)新線索，iTreg細(xì)胞療法更進(jìn)一步
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調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（Treg）作為免疫系統(tǒng)的 “守護(hù)者”，通過特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子 FOXP3 維持免疫耐受，其功能缺陷會導(dǎo)致自身免疫病等多種疾病。然而，體外誘導(dǎo)的 iTreg 細(xì)胞因 FOXP3 表達(dá)不穩(wěn)定，始終是細(xì)胞療法臨床轉(zhuǎn)化的 “絆腳石”。2025 年發(fā)表于《Nature》的研究 “Genome-wide CRISPR screen in human T cells reveals regulators of FOXP3”，通過全基因組 CRISPR 篩選技術(shù)，系統(tǒng)性挖掘 FOXP3 調(diào)控基因，發(fā)現(xiàn) RBPJ 是 iTreg 分化的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，為優(yōu)化 iTreg 細(xì)胞療法提供了全新靶點(diǎn)和機(jī)制解釋。 一、研究背景：iTreg 細(xì)胞的 “穩(wěn)定性困境” 自然調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（nTreg）在胸腺中發(fā)育成熟，F(xiàn)OXP3 表達(dá)穩(wěn)定；而體外通過 TGFβ 和 IL-2 誘導(dǎo) naive CD4+T 細(xì)胞生成的 iTreg 細(xì)胞，常因 FOXP3 表達(dá)波動喪失功能。這種不穩(wěn)定性源于 FOXP3 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性 —— 已知 TGFβ-SMAD 通路、表觀遺傳修飾（如 CNS2 區(qū)域甲基化）參與調(diào)控，但全基因組范圍內(nèi)的關(guān)鍵調(diào)控因子仍不明確。 研究團(tuán)隊(duì)指出，傳統(tǒng)研究多聚焦于 nTreg 的維持機(jī)制，而 iTreg 的分化調(diào)控尚未被系統(tǒng)解析。因此，通過無偏倚的全基因組篩選技術(shù)，挖掘影響 FOXP3 誘導(dǎo)的關(guān)鍵基因，成為突破 iTreg 穩(wěn)定性難題的核心策略。 二、技術(shù)核心：全基因組 CRISPR 篩選的 “高精度搜索” 為系統(tǒng)性尋找 FOXP3 調(diào)控基因，研究團(tuán)隊(duì)建立了基于 SLICE（sgRNA 慢病毒感染結(jié)合 Cas9 電穿孔）的 CRISPR 篩選平臺，其設(shè)計(jì)堪稱 “基因?qū)用娴娘@微鏡”。 1. 篩選設(shè)計(jì)：鎖定 FOXP3 表達(dá)差異的細(xì)胞群體 研究采用覆蓋 19113 個基因的 sgRNA 文庫（77491 條 sgRNA，每個基因 4 條），轉(zhuǎn)染人原代 naive CD4+T 細(xì)胞后，通過 TGFβ、IL-2 等誘導(dǎo) iTreg 分化。72 小時后，通過流式細(xì)胞術(shù)將細(xì)胞分為 FOXP3high（高表達(dá)）和 FOXP3low（低表達(dá)）兩組，利用 MAGeCK 軟件分析兩組 sgRNA 的富集差異，鎖定調(diào)控基因。 篩選結(jié)果顯示，已知調(diào)控因子（如 TGFBR1、SMAD3）的出現(xiàn)驗(yàn)證了方法可靠性，更重要的是發(fā)現(xiàn)了 SMARCB1、MIDN 等新候選基因。其中，RBPJ 作為負(fù)調(diào)控因子表現(xiàn)突出 —— 其 sgRNA 在 FOXP3high 細(xì)胞中顯著富集，提示 RBPJ 缺失可促進(jìn) FOXP3 表達(dá)（圖 1b,c）。 2. 驗(yàn)證策略：從篩選到單基因功能確認(rèn) 為排除假陽性，團(tuán)隊(duì)通過 Cas9-gRNA 核糖核蛋白（RNP）進(jìn)行單基因敲除驗(yàn)證。結(jié)果顯示，RBPJ 敲除后，F(xiàn)OXP3 + 細(xì)胞比例和平均熒光強(qiáng)度（MFI）均顯著升高，且在 5 名獨(dú)立供體中趨勢一致，證明其調(diào)控作用的穩(wěn)健性（圖 1e,g）。 圖 1. 在原代人T細(xì)胞中進(jìn)行的全基因組CRISPR篩選揭示了調(diào)控FOXP3誘導(dǎo)的新型因子 三、機(jī)制解析：RBPJ 如何 “抑制” FOXP3 表達(dá)？ RBPJ 作為 Notch 通路的經(jīng)典下游分子，其調(diào)控 FOXP3 的機(jī)制卻獨(dú)立于 Notch 信號，這一發(fā)現(xiàn)顛覆了傳統(tǒng)認(rèn)知。 1. 不依賴 Notch 的 “獨(dú)立行動” 實(shí)驗(yàn)顯示，干擾 Notch 通路關(guān)鍵分子（如 NOTCH1、MAML1）對 FOXP3 表達(dá)無顯著影響，而 RBPJ 敲除僅在 iTreg 中增強(qiáng) FOXP3 表達(dá)，對 nTreg 無明顯作用。這提示 RBPJ 的調(diào)控具有 “細(xì)胞類型特異性”，且與 Notch 通路無關(guān)（圖 3b）。 2. 與 NCOR-HDAC3 復(fù)合體的 “協(xié)同抑制” 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RBPJ 通過 β- 三葉形 DNA 結(jié)合域與 NCOR（核受體共抑制因子）-HDAC3 復(fù)合體結(jié)合，直接作用于 FOXP3 啟動子。ChIP-seq 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，RBPJ 缺失后，F(xiàn)OXP3 基因區(qū)域的 H3ac、H3K9ac（激活型組蛋白修飾）水平升高，而 HDAC3 抑制劑可逆轉(zhuǎn) RBPJ 過表達(dá)對 FOXP3 的抑制，證明其通過組蛋白去乙�；种妻D(zhuǎn)錄（圖 2f,g）。 圖 2. RBPJ–NCOR–HDAC3 復(fù)合體通過調(diào)控局部組蛋白乙�；苯右种� FOXP3 的表達(dá) 3. 表觀遺傳的 “雙重調(diào)控” 除直接抑制轉(zhuǎn)錄，RBPJ 還影響 FOXP3 的表觀遺傳穩(wěn)定性。RBPJ 敲除后，F(xiàn)OXP3 基因 CNS2 區(qū)域（與長期表達(dá)相關(guān)）的 CpG 甲基化水平顯著降低，且這種去甲基化依賴抗壞血酸（維生素 C），提示 RBPJ 可能通過抑制去甲基化酶活性維持 CNS2 甲基化（圖 3g）。 圖 3. 敲除RBPJ可提升iTreg細(xì)胞中FOXP3的表達(dá)、功能與穩(wěn)定性。 四、功能延伸：Perturb-icCITE-seq 揭示調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 為解析 RBPJ 的全局調(diào)控效應(yīng)，團(tuán)隊(duì)采用 Perturb-icCITE-seq 技術(shù) —— 結(jié)合 CRISPR 擾動與單細(xì)胞蛋白 - 轉(zhuǎn)錄組分析，同時檢測 296 個候選基因敲除后的轉(zhuǎn)錄組和 300 多種蛋白表達(dá)變化。 結(jié)果顯示，RBPJ 敲除后，iTreg 的核心功能基因（如 IL2RA、ENTPD1）表達(dá)上調(diào)，免疫抑制分子（CTLA4、CD39）蛋白水平升高，提示其功能增強(qiáng)。通過共功能模塊分析，RBPJ 被歸為模塊 H，與 NCOR 復(fù)合體（模塊 I）的調(diào)控特征不同，進(jìn)一步支持其獨(dú)立調(diào)控作用（圖 2d,e）。 更關(guān)鍵的是，該技術(shù)驗(yàn)證了 FOXP3 蛋白與 sgRNA 富集的強(qiáng)相關(guān)性（r=-0.71），證明 RBPJ 對 FOXP3 的調(diào)控是直接且特異性的（圖4c）。 圖 4. 利用 Perturb-icCITE-seq 技術(shù)對 FOXP3 調(diào)控因子進(jìn)行驗(yàn)證 五、臨床潛力：RBPJ 敲除 iTreg 的 “功能躍升” 從基礎(chǔ)機(jī)制到臨床前驗(yàn)證，研究團(tuán)隊(duì)通過系列實(shí)驗(yàn)證實(shí) RBPJ 敲除可顯著提升 iTreg 的治療潛力。 1. 體外功能：穩(wěn)定性與抑制能力雙提升 在重復(fù) TCR 刺激和 TNF（炎癥因子）處理下，RBPJ 敲除 iTreg 的 FOXP3 + 細(xì)胞比例仍保持 70% 以上，顯著高于對照組（約 40%）。抑制實(shí)驗(yàn)顯示，其對 CD4+、CD8 + 效應(yīng) T 細(xì)胞的增殖抑制能力提升 2-3 倍，且在 1:16 的低比例下仍有效（圖 5）。 圖 5. 抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)，RBPJ 缺失的 iTreg 細(xì)胞具有更強(qiáng)的抑制活性。 2. 體內(nèi)驗(yàn)證：在 GvHD 模型中展現(xiàn)治療優(yōu)勢 在人源化小鼠模型中，輸注 RBPJ 敲除 iTreg 的小鼠生存率達(dá) 80%，顯著高于對照組（輸注 nTreg 的小鼠生存率約 70%，輸注對照 iTreg 的小鼠僅 30%）。同時，體重下降幅度更小，5 天后仍有 91.5% 的細(xì)胞保持 FOXP3 高表達(dá)，證明其體內(nèi)穩(wěn)定性（圖 6b,c,d）。 圖 6. RBPJ 缺失可增強(qiáng) iTreg 的體內(nèi)穩(wěn)定性及抑制功能 六、技術(shù)創(chuàng)新：聚焦 FOXP3 + 細(xì)胞的 “精準(zhǔn)分析工具” 為克服傳統(tǒng)方法難以聚焦特定細(xì)胞群體的局限，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了三項(xiàng)新技術(shù)，為表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄組分析提供 “靶向視角”： icRNA-seq：通過流式分選 FOXP3 + 細(xì)胞后提取 RNA，精準(zhǔn)分析其轉(zhuǎn)錄組，避免 FOXP3 - 細(xì)胞的干擾； inChIP-seq：針對 FOXP3 + 細(xì)胞進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀，揭示 RBPJ 對 FOXP3 啟動子組蛋白修飾的影響； inATAC-seq：分析 FOXP3 + 細(xì)胞的染色質(zhì)開放性，發(fā)現(xiàn) RBPJ 缺失可增強(qiáng) FOXP3 啟動子和 CNS2 區(qū)域的開放性。 這些技術(shù)解決了 “混合細(xì)胞群體分析掩蓋關(guān)鍵信號” 的難題，為其他轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞特異性調(diào)控研究提供了范式。 七、意義與展望：從基礎(chǔ)研究到細(xì)胞療法的 “橋梁” 這項(xiàng)研究不僅揭示了 FOXP3 調(diào)控的新機(jī)制，更為 iTreg 細(xì)胞療法提供了切實(shí)可行的優(yōu)化策略： 理論突破：發(fā)現(xiàn) RBPJ 這一新型調(diào)控因子，完善了 FOXP3 的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，解釋了 iTreg 與 nTreg 在穩(wěn)定性上的差異。 臨床潛力：通過敲除 RBPJ 增強(qiáng) iTreg 的穩(wěn)定性和功能，為自身免疫病（如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎）、器官移植排斥等疾病的細(xì)胞療法提供了新方案。 技術(shù)啟發(fā)：全基因組 CRISPR 篩選結(jié)合單細(xì)胞多組學(xué)的策略，為其他細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控的研究提供了可借鑒的范式。 從基因?qū)用娴?“地毯式搜索” 到細(xì)胞功能的 “全面升級”，這項(xiàng)研究讓我們離 “可控、穩(wěn)定的 iTreg 療法” 更近了一步�；蛟S在不久的將來，經(jīng)過 RBPJ 調(diào)控優(yōu)化的 iTreg 細(xì)胞，能像訓(xùn)練有素的 “維和部隊(duì)” 一樣，精準(zhǔn)守護(hù)我們的免疫系統(tǒng)，為無數(shù)患者帶來希望。 源井生物依托自主研發(fā)的 CRISPR-iScreen™ 技術(shù)平臺，面向多種科研應(yīng)用場景，構(gòu)建了完善的表型篩選與數(shù)據(jù)分析體系，提供從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到結(jié)果解析的精細(xì)化功能篩選服務(wù)，助力科研高效推進(jìn)。無論是 CRISPR 文庫質(zhì)粒、CRISPR 文庫病毒、CRISPR 文庫 Cell Pool，還是 功能篩選體系搭建、NGS 測序，我們均可提供覆蓋全流程的功能篩選與一站式 CRISPR 篩選服務(wù)，確保各環(huán)節(jié)無縫銜接，讓科研更高效、更輕松。 源井生物即將推出全新文庫自動分析平臺，實(shí)現(xiàn)生信數(shù)據(jù)全自動化處理�？蒲腥藛T無需依賴外部服務(wù)，輕松在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)自主完成CRISPR篩選數(shù)據(jù)分析與結(jié)果可視化，極大提升工作效率，節(jié)省人力和成本，真正做到數(shù)據(jù)“自己來”，科研更高效、更自由！ 參考文獻(xiàn) Chen, K.Y., Kibayashi, T., Giguelay, A. et al. Genome-wide CRISPR screen in human T cells reveals regulators of FOXP3. Nature 642, 191–200 (2025). |
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