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[求助] 流式死活染 & 單細(xì)胞門控設(shè)置被質(zhì)疑，如何優(yōu)化并解釋？ 已有1人參與
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大家好，我的流式 gating 最近被實(shí)驗(yàn)室里一個(gè)非常嚴(yán)謹(jǐn)?shù)睦蠋熧|(zhì)疑了兩點(diǎn)： 死活染電壓過高 審稿人和老師都指出，我在 viability dye（Fixable Viability Dye eFluor™ 506）通道的電壓（PMT）設(shè)得太高，導(dǎo)致陰性和陽性之間的分界不夠清晰。 理想情況下，死細(xì)胞的信號(hào)很亮，活細(xì)胞陰性峰應(yīng)該落在 0–10³ 之間，這樣陽性/陰性分離更明顯。 我現(xiàn)在的圖（P2）分辨率不高，陰性和陽性過渡區(qū)模糊，可能會(huì)造成 gate 不夠干凈。 老師建議調(diào)低電壓或調(diào)整 logicle scale 后再 gating。審稿人也認(rèn)為雖然我最后還是比較準(zhǔn)確地圈出了 live cells，但分辨率不足可能會(huì)影響后續(xù) singlet gate 的干凈程度。 單細(xì)胞 gate（FSC-A vs FSC-H）太陡 我的 singlet gate（P3）是參考文獻(xiàn)畫的，目的是排除 doublets 和緊密貼在一起的細(xì)胞（clustered cells），尤其在中性粒細(xì)胞樣本里這種情況不少。 但老師認(rèn)為我的線太陡，漏掉了一團(tuán)細(xì)胞，懷疑里面可能有一部分是我要分析的目標(biāo)細(xì)胞。 審稿人也提到：理想的單細(xì)胞分布是沿對(duì)角線（FSC-H 稍低于 FSC-A），如果 gate 過陡，可能會(huì)錯(cuò)排一些正常細(xì)胞。我的 singlet yield 目前只有 71% live cells，他建議如果不預(yù)期樣本有很多 doublets/debris，可以把 gate 放得更“平緩”一點(diǎn)。 📌 我的困惑 我參考的文獻(xiàn)確實(shí)是這樣畫 singlet gate 的，去掉的那部分是形態(tài)明顯異常、可能是粘連的細(xì)胞。但老師覺得可能“誤傷”了正常細(xì)胞。 如果我改成平緩一些，最后目的細(xì)胞的比例會(huì)升高一些，但這樣會(huì)不會(huì)引入假陽性？ 死活染的電壓我確實(shí)一開始設(shè)高了，調(diào) logicle scale 有輕微改善，但陰/陽性還是沒法涇渭分明。大家覺得這個(gè)對(duì)結(jié)果的影響大嗎？ 💡 想請教大家 在 死活染分辨率低 的情況下，有沒有后處理或重跑時(shí)的最佳調(diào)整方法？ 單細(xì)胞 gate 陡 vs 平緩，你們在 rare cell subset 分析時(shí)是怎么權(quán)衡靈敏度和特異性的？ 有沒有推薦的參考文獻(xiàn)或示例圖，可以用來和老師解釋“為什么我這樣圈門是合理的”？ 附圖（P2：死活染；P3：單細(xì)胞 gate）👇 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://gaoyang168.com/3g ] |
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