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夏末～易科新蟲 (小有名氣)
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WB實(shí)驗(yàn)原理及流程
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Western Blot（WB）實(shí)驗(yàn)原理及流程圖 一、實(shí)驗(yàn)原理 Western Blot（免疫印跡）是一種用于檢測(cè)特定蛋白質(zhì)在復(fù)雜樣本中表達(dá)水平的技術(shù)。其原理基于以下三個(gè)核心步驟： 1. 蛋白質(zhì)分離 通過 SDS-PAGE 凝膠電泳 將蛋白質(zhì)按分子量大小分離。 SDS（十二烷基硫酸鈉）使蛋白質(zhì)攜帶大量負(fù)電荷，掩蓋天然電荷差異，確保分離僅基于分子量。 PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）提供分子篩效應(yīng)，小分子量蛋白遷移更快，大分子量蛋白遷移更慢。 2. 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜 將凝膠中分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到 固相載體膜（如 PVDF 膜或 NC 膜）上，便于后續(xù)抗體結(jié)合。 常用轉(zhuǎn)膜方法：濕轉(zhuǎn)法（傳統(tǒng)）或半干轉(zhuǎn)法（快速）。 3. 抗體檢測(cè) 一抗：特異性識(shí)別目標(biāo)蛋白的抗體。 二抗：攜帶標(biāo)記（如 HRP 酶、熒光基團(tuán)）的抗體，識(shí)別一抗的 Fc 段。 信號(hào)檢測(cè)：通過化學(xué)發(fā)光（ECL）或熒光顯色，使目標(biāo)蛋白條帶可視化。 二、實(shí)驗(yàn)流程圖 textCopy Code 1. 樣品制備 │ ↓ 2. SDS-PAGE 電泳分離蛋白質(zhì) │ ↓ 3. 轉(zhuǎn)膜（將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上） │ ↓ 4. 封閉（5% 脫脂牛奶或 BSA，阻斷非特異性結(jié)合） │ ↓ 5. 一抗孵育（特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白） │ ↓ 6. 洗滌（去除未結(jié)合的一抗） │ ↓ 7. 二抗孵育（標(biāo)記的二抗結(jié)合一抗） │ ↓ 8. 洗滌（去除未結(jié)合的二抗） │ ↓ 9. 檢測(cè)（ECL 化學(xué)發(fā)光或熒光成像） 三、關(guān)鍵步驟詳解 1. 樣品制備 裂解細(xì)胞/組織，提取總蛋白，測(cè)定濃度后與上樣緩沖液混合并煮沸變性。 2. 電泳 上樣后通電，小分子量蛋白遷移至凝膠下端（可根據(jù)預(yù)染 Marker 判斷分離效果）。 3. 轉(zhuǎn)膜 電流方向垂直于凝膠平面，蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至膜上（需確認(rèn)轉(zhuǎn)膜效率，如麗春紅染色）。 4. 封閉 使用封閉液（如脫脂牛奶）覆蓋膜表面，減少抗體非特異性吸附。 5. 抗體孵育 一抗孵育常需過夜（4℃），二抗孵育時(shí)間較短（室溫 1-2 小時(shí)）。 6. 信號(hào)檢測(cè) 化學(xué)發(fā)光法：HRP 催化底物發(fā)光，通過膠片或成像系統(tǒng)捕獲信號(hào)。 四、注意事項(xiàng) 對(duì)照設(shè)置：需包含陰性對(duì)照（無(wú)目標(biāo)蛋白樣本）、內(nèi)參（如 β-actin/GAPDH）及空白對(duì)照。 抗體選擇：驗(yàn)證一抗特異性，避免交叉反應(yīng)。 時(shí)間控制：轉(zhuǎn)膜時(shí)間過長(zhǎng)可能導(dǎo)致小分子量蛋白穿透膜。 發(fā)自小木蟲手機(jī)客戶端 |
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