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Longlight鐵蟲 (初入文壇)
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[交流]
二代測序文庫篩選步驟
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磁珠進(jìn)行核酸片段篩選的步驟基于SPRI技術(shù)和磁場分離原理，通過磁珠與DNA片段的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)目標(biāo)片段的分離。以下是具體操作流程及關(guān)鍵要點(diǎn)： 一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 1. 磁珠平衡 將磁珠從冰箱取出，室溫平衡至少30分鐘，避免低溫破壞表面修飾基團(tuán)。 2. 試劑配制 現(xiàn)用現(xiàn)配80%無水乙醇（體積比8:2）。 根據(jù)目標(biāo)片段大小選擇磁珠比例（參考各廠家磁珠分選比例表）。 二、雙輪分選法（適用于NGS文庫構(gòu)建） 第一輪：去除大片段（右側(cè)清除） 1. 磁珠與樣本混合 按比例（如0.8×）加入磁珠至DNA溶液中，渦旋混勻或移液器吹打10次，室溫孵育5分鐘。 2. 磁場分離 短暫離心后置于磁力架（如達(dá)遠(yuǎn)辰光磁力架），待溶液澄清（約5分鐘），轉(zhuǎn)移上清至新管，殘留2μL液體于原管底部，避免吸到磁珠。 第二輪：去除小片段（左側(cè)清除） 1. 加入第二輪磁珠 按比例（如0.2×）加入磁珠至第一輪上清中，重復(fù)混勻、孵育步驟。 2. 磁場分離與洗脫 分離后棄上清，用80%乙醇漂洗磁珠2次（每次30秒）。 室溫干燥磁珠至剛出現(xiàn)龜裂（約5分鐘），避免過度干燥。 加入ddH₂O或TE洗脫DNA，室溫孵育5分鐘后回收上清。 三、單側(cè)分選法（適用于去除短片段） 1. 調(diào)整磁珠比例 根據(jù)目標(biāo)片段長度選擇磁珠用量（如去除≥1000bp片段用0.6×，去除≥200bp用2.0×）。 2. 結(jié)合與分離 混勻磁珠與樣本后孵育5分鐘，磁力架分離并棄上清。 乙醇漂洗后洗脫DNA，適用于去除引物二聚體或短片段雜質(zhì)。 四、關(guān)鍵注意事項 1. 分選精度控制 第一輪棄磁珠，第二輪棄上清，確保目標(biāo)片段被保留。 使用Qsep、Agilent 2100 Bioanalyzer驗(yàn)證分選后片段分布。 2. 操作誤差規(guī)避 轉(zhuǎn)移上清時使用200μL+10μL槍頭，防止吸到磁珠。 初始體積≥100μL，不足時補(bǔ)超純水以減少移液誤差。 五、應(yīng)用場景示例 NGS文庫構(gòu)建：通過雙輪分選獲得300-500bp目標(biāo)片段。 病原體檢測：快速分離特定長度的病毒核酸片段。 |
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