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Longlight鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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如何精準(zhǔn)定量核酸濃度
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一、紫外分光光度法（Nanodrop） 原理：核酸的堿基（嘌呤、嘧啶）在260 nm波長(zhǎng)處有最大紫外吸收峰，通過(guò)吸光值（A260）結(jié)合摩爾吸光系數(shù)計(jì)算濃度。DNA的換算系數(shù)為50 μg/mL，RNA為40 μg/mL。 特點(diǎn)： • 操作簡(jiǎn)便，1分鐘內(nèi)完成檢測(cè)。 • 無(wú)法區(qū)分DNA/RNA、降解核酸及雜質(zhì)，需結(jié)合A260/A280（>1.8為DNA純品，>2.0為RNA純品）評(píng)估純度。 • 靈敏度較低（≥2 ng/μL），易受游離核苷酸干擾。 二、熒光染料法（如達(dá)遠(yuǎn)辰光熒光計(jì)） 原理：特異性熒光染料（與目標(biāo)核酸結(jié)合后發(fā)出熒光，通過(guò)熒光強(qiáng)度定量。例如，達(dá)遠(yuǎn)辰光熒光計(jì)搭配賽默飛Qubit dsDNA HS染料檢測(cè)范圍為0.2–100 ng/μL。 特點(diǎn)： • 靈敏度高（pg級(jí)），特異性強(qiáng)，可區(qū)分DNA/RNA。 • 耗材成本相較于紫外分光法較高。 • 適用于低濃度/珍貴樣本（如NGS文庫(kù)）。 三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR） 原理：通過(guò)熒光染料或探針實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程，Ct值與起始模板濃度呈線(xiàn)性關(guān)系，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量。 特點(diǎn)： • 特異性高，依賴(lài)引物/探針設(shè)計(jì)，可檢測(cè)拷貝數(shù)。 • 操作復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，需標(biāo)準(zhǔn)品確保擴(kuò)增效率一致。 • 適用于基因表達(dá)分析、病原體檢測(cè)等。 四、傳統(tǒng)化學(xué)法 1. 定磷法 • 原理：核酸中的磷在酸性條件下與鉬酸銨反應(yīng)生成鉬藍(lán)，在650 nm處測(cè)吸光值，換算濃度。DNA/RNA含磷量分別為9.2%和9.5%。 • 特點(diǎn)：靈敏度較高（1–10 μg），但易受蛋白質(zhì)干擾。 2. 定糖法 • 原理：核酸戊糖經(jīng)酸解生成醛類(lèi)，與成色劑（如苔黑酚）反應(yīng)顯色，670 nm或595 nm測(cè)吸光值。 • 特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，但特異性差，僅適用于粗略估算。 五、其他方法 1. 毛細(xì)管電泳法 • 原理：基于熒光染料結(jié)合核酸，通過(guò)遷移時(shí)間和峰面積定量，可評(píng)估核酸完整性（如RNA降解程度）。 • 特點(diǎn)：靈敏度高（25 ng/μL），但單樣成本較高。 2. 數(shù)字PCR（dPCR） • 原理：將樣本分割成微滴獨(dú)立擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性微滴數(shù)實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，不受擴(kuò)增效率影響。 • 特點(diǎn)：適用于稀有突變檢測(cè)、病毒載量測(cè)定等。 選型建議 • 常規(guī)檢測(cè)：優(yōu)先選擇紫外分光光度法（快速便捷）或Qubit熒光法（高靈敏度）。 • 復(fù)雜樣本：如NGS文庫(kù)，推薦毛細(xì)管電泳或數(shù)字PCR。 • 絕對(duì)定量需求：使用qPCR或數(shù)字PCR |
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