 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 938 | 回復: 0 | |||
[交流]
乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）含量檢測試劑盒實驗解決方案
|
|
原理 乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中。是生物體能源物質(zhì)代謝過程中產(chǎn)生的一種重要的中間代謝產(chǎn)物。在體內(nèi)能源物質(zhì)代謝中是一個樞紐性的物質(zhì)。糖、脂肪、蛋白質(zhì)三大營養(yǎng)物質(zhì)通過乙酰輔酶A匯聚成一條共同的代謝通路--三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化，經(jīng)過這條通路徹底氧化生成二氧化碳和水，釋放能量用于ATP合成。此外，乙酰輔酶A是合成脂肪酸，酮體，膽固醇及其衍生物等生理活性物質(zhì)的前體物質(zhì)。CheKine™ 乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）含量檢測試劑盒（微量法）提供了一種簡單、靈敏、快速的乙酰輔酶A檢測方法，適合多種類型的樣本，如動/植物組織、細胞等樣本。其檢測原理是蘋果酸脫氫酶可催化蘋果酸和NAD生成草酰乙酸和NADH。檸檬酸合酶可催化乙酰輔酶A和草酰乙酸生成檸檬酸和輔酶A。利用蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶的偶聯(lián)反應，乙酰輔酶A含量和NADH的生成速率成正比，NADH在340 nm處有特征吸收峰，通過檢測340 nm吸光值的計算既可得到乙酰輔酶A含量。 自備耗材 ·酶標儀或紫外分光光度計（能測340 nm處的吸光度） ·制冰機，低溫離心機 ·水浴鍋 ·96孔UV板或微量石英比色皿 ·可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭 ·去離子水 ·勻漿器（如果是組織樣本） 試劑準備 Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。 注意：Extraction Buffer有刺激性氣味，建議在通風櫥進行實驗。 Working ReagentⅠ：臨用前配制，對于48 T，加入175 μL ReagentⅣ充分溶解備用；對于96 T，加入350 μL ReagentⅣ充分溶解備用，未用完的試劑-20℃避光分裝保存2周。 Working ReagentⅡ：臨用前配制，對于48 T，加入175 μL ReagentⅣ充分混勻備用；對于96 T，加入350 μL ReagentⅣ充分溶解備用，未用完的試劑4℃避光分裝保存2周。 Working ReagentⅢ：臨用前配制，對于48 T，加入15.75 mL ReagentⅣ充分溶解備用；對于96 T，加入31.5 mL ReagentⅣ充分溶解備用，未用完的試劑-20℃避光分裝保存2周。 工作液：臨用前配制，將Working ReagentI、Working ReagentⅡ和Working ReagentⅢ按照1:1:90的比例混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。 Standard (NADH)：臨用前配制，對于48 T，加入0.5 mL去離子水充分溶解備用；對于96 T，加入1 mL去離子水充分溶解備用，得8,000 nmol/mL標準品，未用完的試劑-20℃避光分裝保存2周。 標準曲線設(shè)置：按照如下表格，用去離子水將8,000 nmol/mL標準品稀釋為3,200、1,600、800、400、200、100、50、0 nmol/mL的標準溶液。 序號 標準液體積 去離子水體積（µL） 濃度（nmol/mL） Std.1 100 µL 8,000 nmol/mL 150 3,200 Std.2 100 µL of Std.1 (3,200 nmol/mL) 100 1,600 Std.3 100 µL of Std.2 (1,600 nmol/mL) 100 800 Std.4 100 µL of Std.3 (800 nmol/mL) 100 400 Std.5 100 µL of Std.4 (400 nmol/mL) 100 200 Std.6 100 µL of Std.5 (200 nmol/mL) 100 100 Std.7 100 µL of Std.6 (100 nmol/mL) 100 50 Std.8 0 200 0 注意：每次實驗都要做一次標準品檢測，制作標曲；稀釋后的標準品溶液不穩(wěn)定，必須在4小時內(nèi)使用。Std.8即空白孔。 樣本制備 注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存1個月。 1.細胞樣本：收集細胞樣本到離心管內(nèi)，棄上清，按照每500萬細胞加入1 mL Extraction Buffer，超聲破碎細胞（功率20%，超聲3 s，間隔10 s，重復30次），13,000 g，4℃離心10 min，取上清，置冰上待測。 2.組織樣本：稱取0.1 g組織，加入1 mL Extraction Buffer，進行冰浴勻漿，13,000 g，4℃離心10 min，取上清，置冰上待測。 注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3002的蛋白質(zhì)定量試劑盒（Bradford法）進行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。 實驗步驟 1.酶標儀或紫外分光光度計預熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長到340 nm，紫外分光光度計用去離子水調(diào)零。 2.工作液于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育10 min。 3.操作表：在96孔UV板或微量石英比色皿中，按照下表進行實驗 試劑 測定孔（μL） 標準孔（μL） 樣本 25 0 不同濃度的Std. 0 25 工作液 230 230 4.混勻，測定孔立即讀取340 nm處20秒的吸光值A(chǔ)1和1分20秒時的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA測定=A2-A1，標準孔讀取340 nm處1分20秒時的吸光值A(chǔ)標準，ΔA標準=A標準-A空白。 注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果吸光度大于1.5，可以減少樣本量，如果吸光度太低，可以減少Extraction Buffer體積。 結(jié)果計算 注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎�，包括推導過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。 以ΔA標準為x軸，標準品濃度為y軸，制作標準曲線，得到方程，將ΔA測定帶入方程，得到y(tǒng)值。 1. 按樣本蛋白濃度計算： 乙酰輔酶A含量(nmol/mg prot)=(y×V樣)÷(V樣×Cpr)=y÷Cpr 2. 按樣本鮮重計算： 乙酰輔酶A含量(nmol/g 鮮重)=(y×V樣)÷(W×V樣÷V提取)=y÷W 3. 按細胞密度計算： 乙酰輔酶A含量(nmol/104 cells)=(y×V樣)÷(500×V樣÷V提取)=y÷500 V樣：加入樣本體積，0.025 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；V提�。杭尤胩崛∫后w積，1 mL；500：細胞總數(shù)，500萬。 結(jié)果展示 參考標曲如下： Figure 1. NADH的標準曲線 |
回復此樓» 猜你喜歡
推薦一些20種氨基酸檢測的實際應用案例
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：實驗器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復
-
化學工程及工業(yè)化學論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有126人回復
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：和實驗材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復
-
蛋白質(zhì)檢測：精準分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴謹設(shè)計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 Abbkine亞科因 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 材料與化工，291分，求調(diào)劑 +6 | 咕嚕咕嚕123123 2026-03-04 | 6/300 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 085600材料調(diào)劑 總分330 +3 | 池池丶 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085701環(huán)境工程 求調(diào)劑 +6 | xiiiia 2026-03-04 | 6/300 |
|
|
[考研] 一志愿東北大學080500，英一數(shù)二343分求調(diào)劑 +3 | Seele_v5 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[論文投稿]
 主編終審卡者不動
 100+3
|
Stray2021 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿鄭州大學，學碩，物理化學， 333求調(diào)劑 +4 | 李魔女斗篷 2026-03-04 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0703化學調(diào)劑 +4 | G212 2026-03-03 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 理學，工學，農(nóng)學調(diào)劑，少走彎路，這里歡迎您！ +8 | likeihood 2026-03-02 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 298求調(diào)劑 +3 | 人間唯你是清歡 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 284求調(diào)劑 +6 | 天下熯 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 268求調(diào)劑 +6 | 好運連綿不絕 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 課題組接收材料類調(diào)劑研究生 +6 | gaoxiaoniuma 2026-02-28 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 0856求調(diào)劑285 +11 | 呂仔龍 2026-02-28 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 302材料工程求調(diào)劑 +5 | Doleres 2026-03-01 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 265分求調(diào)劑不調(diào)專業(yè)和學校有行學上就 +6 | 禮堂丁真258 2026-02-28 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 275求調(diào)劑 +3 | L-xin? 2026-03-01 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 材料類求調(diào)劑 +11 | wana_kiko 2026-02-28 | 14/700 |
|
|
|
[基金申請]
本子寫完了，給DS兄弟看了，得了92分
+3
|
Doma 2026-03-01 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 291分工科求調(diào)劑 +9 | science餓餓 2026-03-01 | 10/500 |
|
|
|
[論文投稿]
Optics letters投稿被拒求助
30+3
|
luckyry 2026-02-26 | 4/200 |
|