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羥基抗氧化能力（HORAC）檢測試劑盒實驗解決方案
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原理 羥基抗氧化能力（Hydroxyl Radical Absorbance Capacity, HORAC）是一種檢測各種樣品中生物分子抗氧化能力的方法，可反映抗氧化劑轉移羥自由基的能力。CheKine™ 羥基抗氧化能力（HORAC）檢測試劑盒（熒光法）可檢測動物或植物組織、細胞或細菌、血清（漿）等樣本，其原理是以熒光素鈉為熒光探針，芬頓反應產(chǎn)生羥自由基，根據(jù)羥自由基破壞熒光探針，使熒光強度產(chǎn)生變化，熒光強度的變化大小反映自由基破壞的程度。在抗氧化劑存在時，它可以抑制由自由基引起的熒光變化。抑制程度反映了它對自由基的抗氧化能力。 自備耗材 ·熒光酶標儀（激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為525 nm） ·全黑96孔板、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭 ·低溫離心機、恒溫箱、制冰機 ·去離子水、PBS (pH 7.4)、丙酮 ·勻漿器（如果是組織樣本） 試劑準備 1×Assay Buffer：使用前，Assay Buffer (2×)用去離子水稀釋成1×Assay Buffer，充分溶解待用。4℃保存。 1×ReagentⅠ：使用前，ReagentⅠ(100×)用1×Assay Buffer稀釋成1×ReagentⅠ，充分溶解待用。用不完的ReagentⅠ(100×)在-20℃避光分裝保存，避免反復凍融。不要儲存稀釋的1×ReagentⅠ溶液。 1×ReagentⅡ：使用前，ReagentⅡ(32×)用去離子水稀釋成1×ReagentⅡ，充分溶解待用。4℃避光保存。 注意：ReagentⅡ有一定的刺激性，建議在使用過程中做好個人防護。 ReagentⅢ：即用型；使用前，平衡到室溫。用不完的試劑在-20℃避光分裝保存，避免反復凍融。 Trolox Standard (5 mM)：使用前，用1×Assay Buffer稀釋成0.1 mM濃度，充分溶解待用。用不完的Trolox Standard（5 mM）-20℃避光分裝保存，避免反復凍融。 Standard設置：按下表所示，配制標準品溶液。 序號 0.1 mM標準品體積（µL） 1×Assay Buffer體積（µL） 標準品濃度（µM） Std.1 80 120 40 Std.2 40 160 20 Std.3 20 180 10 Std.4 10 190 5 Std.5 5 195 2.5 Std.6 2.5 197.5 1.25 Std.7 0 200 0 注意：每次實驗都要做一次標準品檢測，制作標曲；稀釋后的標準品溶液不穩(wěn)定，必須在4小時內(nèi)使用。 樣本制備 注意：樣本以新鮮為宜，若不能立刻檢測，應儲存在-80℃保存1個月。 1. 動物組織：稱取0.1 g樣本，加入1 mL冷的1×Assay Buffer，冰浴勻漿，10,000 g，4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測。 2. 植物組織：稱取0.1 g樣本，加入1 mL冷的1×Assay Buffer搗碎，冰浴超聲波破碎5 min（功率20%或200 W，超聲3 s，間隔7 s，重復30次），10,000 g，4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測。 3. 細胞或細菌：收集500萬細胞或細菌到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細胞，離心后棄上清，加入1 mL冷的1×Assay Buffer，冰浴超聲波破碎5 min（功率20%或200 W，超聲3 s，間隔7 s，重復30次），10,000 g，4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測。 4. 血漿或血清：用1×Assay Buffer稀釋10倍或更多進行檢測。 5. 液體樣本：10,000 g，4℃離心10 min，去除微粒，取上清液，置冰上待測。在進行測定之前，根據(jù)需要稀釋上清液。 6. 親脂性樣本：親脂性樣本溶于100%丙酮中，用50%丙酮稀釋，在室溫下孵育1 h，10,000 g，4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測。在進行測定之前，根據(jù)需要稀釋上清液。 7. 固體或高蛋白樣本：稱取固體樣本，加入去離子水（1:2，W/V），冰浴勻漿，10,000 g，4℃離心10 min，取水溶性部分的上清液。不溶物部分用去離子水洗滌，將此洗滌液與水溶性的上清液混合，合并的上清液可以用1×Assay Buffer稀釋并直接用于分析。而不溶物部分加入純丙酮（1:4, w/v）在室溫下混合30-60 min來進一步提取。10,000 g，4℃離心10 min，取丙酮提取物的上清液用50%丙酮稀釋。通過將水溶性部分和不溶物部分的丙酮提取物的結果相結合，計算出總HORAC值。 注意：該試劑盒提取的樣本也可以適用于KTB1501的測定。 實驗步驟 1. 熒光酶標儀預熱到37℃，調(diào)節(jié)激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為525 nm。 2. 操作表（下述操作在全黑96孔板中操作）： 試劑 空白孔（μL） 標準孔（μL） 測定孔（μL） 1×Assay Buffer 20 0 0 Standard 0 20 0 上清 0 0 20 1×ReagentⅠ 140 140 140 混勻，37℃孵育30 min 1×ReagentⅡ 20 20 20 ReagentⅢ 20 20 20 3. 混勻，立即用熒光酶標儀讀取熒光值，每5 min讀取1次，總共60 min。熒光酶標儀的測定條件為激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為525 nm，儀器溫度保持在37℃。 注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。空白孔的最終測定值應小于初始值的10%。 結果計算 HORAC值根據(jù)熒光衰減曲線下凈面積(Area Under the Curve, AUC)=[AUC待測樣(抗氧化劑)-AUC(空白)]計算抗氧化劑的活性。 1. 從下面的等式計算AUC AUC=1+RFU1/RFU0+RFU2/RFU0+RFU3/RFU0+……+RFU59/RFU0+RFU60/RFU0 RFU0=0 min的相對熒光值。 RFUx=x min的相對熒光值（例如，RFU5是5 min時的相對熒光值）。 2. 計算凈AUC：凈AUC=AUC(樣本)-AUC(空白)。 3. 標準曲線的繪制：以標準品濃度為y軸，凈AUC為x軸，繪制標準曲線。 4. 將樣本的凈AUC帶入方程得到y(tǒng)值（μM），以微摩爾每升Trolox當量（TE）或每克樣品的TE（μmol TE/ g或μmol TE/ L）表示HORAC值。 注意：若樣本進一步稀釋，則需要再乘以進一步稀釋的稀釋倍數(shù)n。 結果展示 典型標準曲線： Figure 1. HORAC的標準曲線 示例： 取0.1 g植物組織加入1 mL 1×Assay Buffer進行勻漿研磨，取上清，之后按照測定步驟操作，用全黑96孔板測得： 樣本的AUC為9.199，空白的AUC為1.937，凈AUC=AUC(樣本)-AUC(空白)=9.199-1.937=7.262，標準曲線為y=4.2835x-0.11，Trolox濃度為30.997 µM，HORAC值（樣本）=30.997 µM=30.997 µM TE=30.997 µmol TE/L。 |
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