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Abbkine亞科因新蟲 (初入文壇)
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細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)試劑盒（CCK-8法）實(shí)驗(yàn)操作步驟
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原理 細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)試劑盒（CCK-8法）是基于高度水溶性的四唑鹽WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)來(lái)進(jìn)行測(cè)定的。WST-8在電子介體的作用下可還原生成水溶性甲瓚產(chǎn)物，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。CCK-8是非放射性的，可在細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行靈敏的比色測(cè)定，從而計(jì)算出細(xì)胞數(shù)量。WST-8被細(xì)胞中的脫氫酶還原而生成橙色產(chǎn)物（甲瓚），可溶于組織培養(yǎng)基中。細(xì)胞中脫氫酶產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物的量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。CCK-8試劑盒檢測(cè)靈敏度高于其他四唑鹽（例如MTT，XTT，MTS或WST-1）。 自備耗材 ·酶標(biāo)儀（能測(cè) 450 nm 處的吸光值）及二氧化碳培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2） ·96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，透明平底、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭 試劑準(zhǔn)備 CCK-8溶液：即用型，無(wú)需預(yù)混合組分。 實(shí)驗(yàn)流程 細(xì)胞計(jì)數(shù)方案 1.在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100 μL/孔），將板在潮濕的培養(yǎng)箱中預(yù)先培養(yǎng)（37℃，5% CO2）； 2.在平板的每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8溶液，注意不要將氣泡引入孔中，因?yàn)樗鼈儠?huì)干擾OD值讀��； 3.在培養(yǎng)箱中將平板孵育1-4 h；時(shí)間的長(zhǎng)短根據(jù)細(xì)胞的類型和細(xì)胞的密度等實(shí)驗(yàn)情況而定； 4.使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度。 細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)方案 1.在96孔板中接種100 μL細(xì)胞懸液（5,000個(gè)細(xì)胞/孔），將板在潮濕的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h (37℃，5% CO2）； 2.在平板中加入1-10 μL各種濃度的待測(cè)物質(zhì)； 3.在培養(yǎng)箱中將平板孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（例如6、12、24或48 h）； 4.向板的每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8溶液，注意不要將氣泡引入孔中，因?yàn)樗鼈儠?huì)干擾OD值讀��； 5.在培養(yǎng)箱中將平板孵育1-4 h；時(shí)間的長(zhǎng)短根據(jù)細(xì)胞的類型和細(xì)胞的密度等實(shí)驗(yàn)情況而定； 6.使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度。 結(jié)果計(jì)算 細(xì)胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100% 抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100% As：實(shí)驗(yàn)孔吸光度（含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液和藥物溶液）； Ac：對(duì)照孔吸光度（含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含藥物）； Ab：空白孔吸光度（含培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含細(xì)胞、藥物）。 注意事項(xiàng) 1.由于CCK-8分析基于活細(xì)胞中脫氫酶活性的檢測(cè)，因此影響活細(xì)胞中脫氫酶活性的條件或化學(xué)物質(zhì)可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)際活細(xì)胞數(shù)與使用CCK-8分析確定的細(xì)胞數(shù)之間存在差異； 2.混合或重懸組分時(shí)，避免產(chǎn)生氣泡，因?yàn)樗鼈儠?huì)影響OD值讀��； 3.孵育時(shí)間因孔中細(xì)胞的類型和數(shù)量而異。通常，白細(xì)胞著色較弱，因此可能需要較長(zhǎng)的孵育時(shí)間（最多4 h）或大量細(xì)胞（~105個(gè)細(xì)胞/孔）； 4.如果由于長(zhǎng)期培養(yǎng)而改變了培養(yǎng)基的顏色或pH，請(qǐng)?jiān)谔砑覥CK-8時(shí)更換培養(yǎng)基； 5.由于CCK-8的毒性低，因此相同的細(xì)胞可用于其他細(xì)胞分析。 6.一般情況下OD值范圍在0.1-2.0都可以，在1.0附近比較好。一般可將對(duì)照孔吸光度（含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含藥物）的OD值控制在0.8-1.0左右，確定細(xì)胞的檢測(cè)數(shù)量和孵育時(shí)間。 |
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