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國自然熱點”巨噬細胞“和成纖維細胞聯(lián)合，攻下一區(qū)
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在纖維化肺組織中，由于收縮性肌成纖維細胞活躍的細胞外基質（ECM）重塑，過度積累的纖維性膠原經(jīng)常排列成致密束。這種病理上的組織微環(huán)境也為嵌入細胞提供了地形線索，導致細胞功能的變化，如它們的形態(tài)和排列。為了簡單起見，在體外產(chǎn)生的CD206陽性巨噬細胞通常被稱為M2表型。吡非尼酮（PFD）是美國食品和藥物管理局（FDA）批準的抗纖維化藥物，作用于多種纖維化途徑。PFD減少成纖維細胞增殖，抑制轉化生長因子-β（TGF-β）途徑。最近的研究表明，PFD還可以調節(jié)巨噬細胞的極化和纖維化活性，但由于這些研究是在動物模型中進行的，因此尚不清楚這些發(fā)現(xiàn)是否適用于人類。缺乏與人類相關的、模擬疾病的研究模型一直是抗纖維化藥物開發(fā)的主要障礙之一。 二 研究思路 通過對人纖維化肺樣本的組織學和單細胞測序分析，我們發(fā)現(xiàn)纖維化巨噬細胞在纖維化肺微環(huán)境中被機械激活。我們用共培養(yǎng)的人巨噬細胞和肺成纖維細胞的模擬巨噬細胞的纖維化微組織模型，原纖維化巨噬細胞被植入到這個組織中被機械激活，它們與膠原纖維和成纖維細胞的廣泛共排列促進了肺微組織中廣泛的纖維形成。PFD治療破壞了M2巨噬細胞的極化和機械活化，導致纖維化抑制。我們發(fā)現(xiàn)PFD通過抑制整合素αMβ2（CD11b/CD18）和Rhoassociated kinase 2（ROCK2）來抑制巨噬細胞的機械激活，這是PFD的一個未知的作用機制。總之，這些結果揭示了一種以前未確定的機制，通過這種機制，機械激活的巨噬細胞在組織水平上促進肺纖維化。異質細胞力傳感顯微組織模型是研究免疫-基質細胞復雜相互作用和抗纖維化藥物作用機制的有力工具。 三 結果 1. 巨噬細胞對地形控制的組織重塑有機械反應 為了解巨噬細胞如何對纖維化肺組織中所見的重塑組織結構做出反應，研究人員創(chuàng)建具有控制形態(tài)和細胞與ECM對齊的工程微組織。將正常人肺成纖維細胞（NHLFs）與I型膠原混合，并將其植入微孔中，微孔中含有一組按拓撲模式排列的微柱。圖案設計包括螺旋圖案（圖2A）、菱形圖案（圖2B）和方形圖案（圖2C），以模擬肺組織中的各種幾何形狀，如高度彎曲的肺泡壁。成纖維細胞產(chǎn)生收縮力，使膠原ECM緊貼微柱。作為成纖維細胞介導的ECM重塑的結果，形態(tài)學控制的微組織按照微柱陣列模式模板形成。微組織中的NHLF和膠原纖維沿著微柱邊界條件定義的張力線強烈共排列。因此，控制細胞和ECM纖維排列提供一個機會來觀察到組織地形的反應。接下來，將來自人外周血的單核細胞用白細胞介素-4（IL-4）和IL-13進行預極化，然后將其植入NHLF重建的顯微組織中。這些M2巨噬細胞在48小時內粘附在顯微組織表面，呈與膠原纖維和NHLF對齊的細長紡錘形形態(tài)（圖2D至F、J、K）。共聚焦成像顯示，巨噬細胞至少部分穿透微組織，并與周圍的膠原纖維和NHLF在三維上相互作用，如膠原纖維和巨噬細胞重疊所示（圖2G-I）。在沿螺旋形微組織高度彎曲邊緣排列的細長巨噬細胞中檢測到強表達整合素β2（CD18），提示巨噬細胞與周圍膠原纖維和NHLFs之間的相互作用涉及機械轉導。這些發(fā)現(xiàn)表明，M2巨噬細胞在纖維化樣組織微環(huán)境中具有感知地形信號的能力，并根據(jù)這些信號動態(tài)調整其機械轉導途徑。 圖片 圖2 巨噬細胞機械激活響應地形控制組織重塑 2. 巨噬細胞和成纖維細胞之間的廣泛共排列促進了工程微組織中廣泛的纖維化反應 接下來，研究人員試圖探究在巨噬細胞-NHLF共培養(yǎng)的微組織中，纖維化巨噬細胞如何促進纖維化的形成。將纖維化的M2巨噬細胞引入到NHLF填充的微組織表面（圖3A）。共培養(yǎng)3天后，在微組織中觀察到α-SMA的高表達，表明NHLF激活到肌成纖維細胞（圖3B）。M2巨噬細胞共培養(yǎng)的微組織中α-SMA的表達水平明顯高于僅NHLF的微組織（4.7倍），但略低于TGF-β1處理的陽性對照（圖3B-C）。由于分化的肌成纖維細胞已顯示出產(chǎn)生高收縮力，研究人員使用原位微柱力傳感器測量單培養(yǎng)和共培養(yǎng)微組織中產(chǎn)生的收縮力。與NHLF單獨培養(yǎng)的微組織相比，M2巨噬細胞與NHLF共培養(yǎng)的微組織產(chǎn)生的收縮力高5.7倍（圖3D）。當單核細胞或巨噬細胞單獨接種膠原基質時，它們不能致密化膠原并形成微組織，這表明這些細胞缺乏收縮力的產(chǎn)生。與收縮力測量類似，巨噬細胞-成纖維細胞共培養(yǎng)的微組織上清中活性TGF-β水平高于NHLF單培養(yǎng)的微組織（圖3E），提示旁分泌TGF-β信號在巨噬細胞介導的組織纖維化中的潛在作用。由于早期研究表明巨噬細胞對成纖維細胞的激活主要發(fā)生在近距離，因此我們在共培養(yǎng)的微組織中檢測兩種細胞的作用情況。在高顯微鏡分辨率下可觀察到單個巨噬細胞接近和/或直接接觸肌成纖維細胞（圖3F）。TGF-β免疫染色顯示TGF-β信號與CD206共定位，而與α-SMA不共定位，提示這些TGF-β由巨噬細胞分泌并沉積到ECM中（圖3G）。 圖片 圖3 巨噬細胞和成纖維細胞之間廣泛的共排列促進了微組織中廣泛的纖維化反應 3. PFD抗纖維化治療對巨噬細胞誘導的纖維化有作用 PFD和尼達尼布是FDA批準的治療肺纖維化的唯一藥物，兩者在纖維化組織中的作用模式和細胞靶點都不明確。研究人員構建的巨噬細胞-NHLF共培養(yǎng)微組織（MaFiCo）是研究抗纖維化藥物作用的一個很好的纖維化模型。作為一種范例藥物，研究人員將PFD應用于我們的顯微組織模型，使用（i）預防性治療，（ii）治療性治療和（iii）預處理。這些不同方案的目的是研究PFD在沒有預先存在的纖維化狀況（預防性治療）或預先存在的纖維化狀況（治療性治療）下的作用。在預防性治療中，將PFD與巨噬細胞一起引入到NHLF填充的微組織中，并在共培養(yǎng)中維持3天（圖4A）。與未處理的對照組相比，在濃度為10和1000 μg/ml時，預防性PFD治療顯著降低粘附的巨噬細胞數(shù)量（圖4B-C），NHLFs中α-SMA表達量分別降低80%和95%（圖4B和D），微組織收縮力分別降低90%和144%（圖4E）。10 μg/ml的PFD對培養(yǎng)上清中的活性TGF-β沒有明顯抑制作用，但在1000 μg/ml的濃度下，活性TGF-β水平降低62%（圖4F）。這些結果表明，在臨床相關濃度（10 μg/ml）下，預防性PFD治療已能有效抑制幾種促纖維化因子。在最高濃度為1000 μg/ml時，PFD幾乎完全消除巨噬細胞對微組織表面的粘附、NHLF中α-SMA的表達（圖4B）、ECM中沉積的TGF-β和微組織中纖維連接蛋白的表達。在這種情況下，少數(shù)剩余的巨噬細胞表現(xiàn)出超細長的形狀，這與未經(jīng)治療的對照組的紡錘體形狀明顯不同（圖4B）。由于在預防性治療中，微組織不具有預先存在的纖維化特征，這些結果表明，破壞巨噬細胞對微組織的粘附抑制纖維化的發(fā)展。 圖片 圖4 預防性抗纖維化治療對共培養(yǎng)微組織的影響 在治療方案中，巨噬細胞與NHLF共培養(yǎng)3天形成纖維化微組織，然后再引入PFD 3天（圖5A）。與未處理的對照顯微組織相比，PFD治療僅適度減少附著的巨噬細胞數(shù)量（40%）（圖5B-C），NHLFs中α-SMA表達（47.5%）（圖5B和D），以及上清中活性TGF-β水平（圖5F）。PFD處理下顯微組織收縮力的變化不顯著（圖5E）。此外，PFD處理導致粘附的巨噬細胞形態(tài)從紡錘形到絲狀，發(fā)生顯著變化（圖5B），這在預防性治療中可以看到。然而，與預防治療相比（圖4C），治療治療中更多的巨噬細胞仍然粘附（圖5C）。 圖片 圖5 治療性抗纖維化治療對共培養(yǎng)微組織的影響 由于PFD治療同時影響巨噬細胞和NHLF，研究人員接下來用PFD預處理巨噬細胞，以消除其對這兩種細胞類型的影響。首先用巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）處理人外周血源性單核細胞，然后加入PFD處理24小時，再用IL-4/IL-13誘導M2極化24小時（圖6A）。在誘導的M2極化過程中加入PFD可以抑制CD206的表達，并以劑量依賴的方式降低巨噬細胞單培養(yǎng)上清中的活性TGF-β水平，而不影響細胞活力或塑料培養(yǎng)皿上的粘附。然后將這些預處理的巨噬細胞接種到NHLF填充的微組織中，并在不進一步添加PFD的情況下維持。共培養(yǎng)3天后，在10和1000 μg/ml的PFD預處理下，粘附的巨噬細胞數(shù)量分別減少59%和72%（圖6B-C），NHLFs中α-SMA的表達分別減少80%和93%（圖6,B和D），顯微組織收縮力分別減少100%（圖6E），活性TGF-β水平分別減少了35%和50%（圖6F）。綜上所述，這些結果表明PFD既抑制巨噬細胞誘導的M2極化，也抑制巨噬細胞粘附于NHLF填充的顯微組織的能力。由于這兩種功能都與巨噬細胞介導的纖維化有關，PFD可能作用于巨噬細胞，影響它們對纖維化過程的貢獻。 圖片 圖6 抗纖維化預處理對共培養(yǎng)微組織的影響 4. PFD通過抑制ROCK2和整合素αMβ2抑制巨噬細胞的機械活化 PFD治療降低巨噬細胞在顯微組織上附著、排列和擴散的能力，這些都是依賴于細胞粘附的細胞功能。反過來，M2極化已被證明需要強粘附和細胞內細胞骨架重組。同時，研究人員在已發(fā)表的IPF患者肺巨噬細胞scRNA-seq數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)與機械轉導過程相關的上調基因，如細胞-基質粘附、整合素介導的信號傳導和細胞運動（圖1）。在這些基因中，RAS同源家族成員A（RHOA），ITGAM和高度上調的基因都與細胞-基質粘附和整合素介導的信號傳導密切相關。因此，一研究人員將重點放在RhoA相關通路、αM整合素和β2整合素上，以研究PFD是否通過作用于巨噬細胞的機械感知和激活來抑制纖維形成。Rho相關激酶ROCK1和ROCK2是RhoA的主要下游效應物，ROCK2在抗纖維化藥物KD025的臨床試驗中被用作治療靶點。共培養(yǎng)微組織中ROCK2免疫染色顯示，ROCK2主要在M2巨噬細胞中表達。在預防和治療兩種治療方案中，PFD治療導致ROCK2表達分別降低65%和74%（圖7A-C）。接下來，用ROCK2特異性抑制劑KD025處理共培養(yǎng)的微組織，以確定對巨噬細胞機械激活的抑制是否是ROCK2特異性的。結果顯示，KD025在預防性和治療性治療中分別導致ROCK2表達降低39%和21%（圖7A-C），同時粘附的巨噬細胞數(shù)量顯著減少（預防性75%，治療性67%）（圖7D-E），巨噬細胞形態(tài)從紡錘形轉變?yōu)榻z狀，活性TGF-β顯著降低（預防組62%，治療組15%）（圖7F-G）。為確定上述作用是否對巨噬細胞具有特異性，研究人員在硅膠基質（剛度為4 MPa）上對單培養(yǎng)M2巨噬細胞進行PFD和KD025處理。如附屬圖所示，PFD處理和KD025處理顯著降低ROCK2的表達，同時巨噬細胞數(shù)量減少，活性TGF-β減少40%和35%，表明ROCK2途徑的抑制是M2巨噬細胞特異性的。接下來，研究人員檢測αM和β2整合素在共培養(yǎng)顯微組織中的表達。免疫染色顯示這些整合素僅在M2巨噬細胞中表達。在預防和預處理方案中，PFD治療導致αM和β2整合素亞基的表達分別減少64%和83%（圖7H-I）。為確定這種作用是否對巨噬細胞具有特異性，對單培養(yǎng)的M2巨噬細胞進行PFD治療。在單一栽培中，PFD處理也顯著降低αM和β2整合素的表達。由于RhoA/ROCK信號通路影響整合素的表達，研究人員也使用KD025處理M2巨噬細胞單培養(yǎng)。KD025抑制ROCK2顯著降低αM和β2整合素的表達。綜上所述，PFD對巨噬細胞包括ROCK2、αM和β2整合素在內的機械轉導通路具有抑制作用，其作用與ROCK2選擇性抑制劑KD025相似。 圖片 圖7 PFD通過抑制ROCK2和整合素αMβ2抑制巨噬細胞的機械活化 |
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