 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 491 | 回復: 0 | |||
[交流]
細胞免疫熒光，看完必會！
|
|
一、免疫熒光技術(shù) 免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術(shù)，是標記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。 用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測或定位抗體，但是在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習慣稱為熒光抗體技術(shù)，或稱為免疫熒光技術(shù)。以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細胞（或組織）化學技術(shù)。 該技術(shù)的主要特點是：特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復雜。 二、細胞免疫熒光 主要應(yīng)用于細胞內(nèi)抗原抗體檢測，適用于細胞水平實驗。 直接法 將標記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標本上，經(jīng)一定的溫度和時間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。 間接法（較為常用） 如檢查未知抗原，先用已知未標記的特異抗體（第一抗體）與抗原標本進行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標記的抗抗體（第二抗體）與抗原標本反應(yīng)，使之形成抗體—抗原—抗體復合物，再用水洗去未反應(yīng)的標記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。 操作步驟（以檢測細胞內(nèi)病毒抗原為例） 倒出培養(yǎng)液。 潤洗，將1ml SD完全培養(yǎng)基沿培養(yǎng)板緩慢打入，蓋上蓋子，輕柔搖晃，先使用1ml的槍沿側(cè)壁吸出潤洗后，再使用200ul的槍沿壁吸出殘液。 吹打，加入2ml SD完全培養(yǎng)基，打在培養(yǎng)板底部，然后反復抽打，直至培養(yǎng)板底部由磨玻璃樣變?yōu)橥该�。（吹打之后放置，后使用之前都要反復吹打�? 將細胞爬片放入24孔板，每孔一個（注意每個孔只放一個，不要多放，注意檢查）。 往（3）中吹打后的細胞液中繼續(xù)加4ml的SD完全培養(yǎng)基（即總計6ml）。將細胞液分裝到24孔板中（分裝之前吹打，防止細胞沉降而造成的不均勻），每個板500ul。注意事項：每一步打開細胞培養(yǎng)時，防止細胞培養(yǎng)板蓋時勿使細胞培養(yǎng)板蓋朝上放置。 在將細胞培養(yǎng)板放于培養(yǎng)箱之前，請噴酒精。 細胞培養(yǎng)24小時之內(nèi)使用，最好20小時。沿側(cè)壁吸出培養(yǎng)液。1PBS潤洗2次，沿側(cè)壁打入1ml或500ul PBS，輕柔搖勻2-3次后，沿側(cè)壁吸出。 Pfu number/細胞數(shù)=pfuV/細胞數(shù)=感染復數(shù) 感染復數(shù)為2，加病毒20ul + 480ul SD培養(yǎng)液 感染復數(shù)為15，加病毒150ul + 480ul SD培養(yǎng)液 病毒滴數(shù)經(jīng)提前測定為1*10-7pfu/ml 先加SD培養(yǎng)基再加病毒。（24h或48h之后進行（10）） 固定細胞：吸出上清，加4%PFA（組織固定液），1ml/孔，室溫下30min。 PBS洗2次，5min/次，1ml/孔。 細胞破膜：0.1% Triton in PBS(PBST,T為Triton) ，PBS：Triton=1L：1ml或100ml:0.1ml。1ml/孔，室溫1h。 封閉：5% BSA in PBST（T:0.5%Tween）=BSA + PBST (100ml PBST 中添加5g BSA ) PBST=PBS+Tween(1L PBS中添加500ulTween) BSA 為牛血清白蛋白。1ml/孔，室溫下2h。 一抗：用封閉液按1：100（比例依照抗體說明書）稀釋，300ul/孔，4攝氏度過夜。 PBST（Tween）洗3次，10min/次 。 二抗（4℃抗體熒光抗體）：用PBST（Tween）按1：1000稀釋，300ul/孔，室溫避光1h。 PBST（Tween）洗3次，1ml/孔，10min/次。（18） DPAI ，300ul/孔，室溫避光10分鐘。 PBS 洗2次，1ml/孔，立馬抽出。 載玻片上滴加封片液，細胞爬片的細胞層與封片液接觸。 熒光共聚焦顯微鏡觀察。 |
回復此樓» 猜你喜歡
085600 材料與化工 298
已經(jīng)有8人回復
-
266求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復
-
0854總分272
已經(jīng)有6人回復
-
EST拒稿重投
已經(jīng)有3人回復
-
歡迎采礦、地質(zhì)、巖土、計算機、人工智能等專業(yè)的同學報考
已經(jīng)有11人回復
-
0703化學學碩 288分
已經(jīng)有4人回復
-
接收調(diào)劑
已經(jīng)有23人回復
-
化學 0703求調(diào)劑 總分293 一志愿211
已經(jīng)有3人回復
-
304分材料專碩求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復
-
0703化學 學碩 理工科均可 不區(qū)分研究方向 總分279求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 基礎(chǔ)生物實驗外?/a> 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 266求調(diào)劑 +5 | 哇塞王帥 2026-03-03 | 5/250 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 304分材料專碩求調(diào)劑 +3 | qiuzhigril 2026-03-03 | 5/250 |
|
|
[基金申請]
 成果系統(tǒng)訪問量大，請15分鐘后再嘗試。由此給您造成的不便，敬請諒解。
+9
|
xhuama 2026-03-02 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 291求調(diào)劑 +4 | Afy123456 2026-03-03 | 7/350 |
|
|
|
[考博] 26申博 求博導 +3 | 愛讀書的小帥 2026-02-28 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 中國林科院林化所（南京）2026年招收化學/材料/環(huán)境工程等背景碩士研究生3名 +3 | realstar2006 2026-02-27 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0856材料工程，初試313調(diào)劑 +7 | 賣個關(guān)子吧 2026-03-03 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 298求調(diào)劑一志愿中海洋 +3 | lour. 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 理學，工學，農(nóng)學調(diào)劑，少走彎路，這里歡迎您！ +8 | likeihood 2026-03-02 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 085700資環(huán)求調(diào)劑，初始279，六級已過，英語能力強 +3 | 085700資環(huán)調(diào)劑 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工調(diào)劑 280分 +10 | yyqqhh 2026-03-03 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 289求調(diào)劑 +7 | BrightLL 2026-03-02 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 化學0703求調(diào)劑 學碩 理/工科均可 總分279 +3 | 1一11 2026-03-03 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 302材料工程求調(diào)劑 +5 | Doleres 2026-03-01 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 292求調(diào)劑 +7 | yhk_819 2026-02-28 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿鄭大材料學碩298分，求調(diào)劑 +6 | wsl111 2026-03-01 | 6/300 |
|
|
|
[基金申請] 成果系統(tǒng)訪問量大，請一小時后再嘗試。---NSFC啥時候好哦，已經(jīng)兩天這樣了 +4 | NSFC2026我來了 2026-02-28 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 290求調(diào)劑 +9 | 材料專碩調(diào)劑； 2026-02-28 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 307求調(diào)劑 +4 | 73372112 2026-02-28 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +3 | 52hz~~ 2026-02-28 | 5/250 |
|