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細(xì)胞免疫熒光，看完必會！
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一、免疫熒光技術(shù) 免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。 用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測或定位抗體，但是在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù)，或稱為免疫熒光技術(shù)。以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）化學(xué)技術(shù)。 該技術(shù)的主要特點是：特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。 二、細(xì)胞免疫熒光 主要應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)抗原抗體檢測，適用于細(xì)胞水平實驗。 直接法 將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定的溫度和時間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。 間接法（較為常用） 如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。 操作步驟（以檢測細(xì)胞內(nèi)病毒抗原為例） 倒出培養(yǎng)液。 潤洗，將1ml SD完全培養(yǎng)基沿培養(yǎng)板緩慢打入，蓋上蓋子，輕柔搖晃，先使用1ml的槍沿側(cè)壁吸出潤洗后，再使用200ul的槍沿壁吸出殘液。 吹打，加入2ml SD完全培養(yǎng)基，打在培養(yǎng)板底部，然后反復(fù)抽打，直至培養(yǎng)板底部由磨玻璃樣變?yōu)橥该鳌＃ù荡蛑蠓胖�，后使用之前都要反�?fù)吹打） 將細(xì)胞爬片放入24孔板，每孔一個（注意每個孔只放一個，不要多放，注意檢查）。 往（3）中吹打后的細(xì)胞液中繼續(xù)加4ml的SD完全培養(yǎng)基（即總計6ml）。將細(xì)胞液分裝到24孔板中（分裝之前吹打，防止細(xì)胞沉降而造成的不均勻），每個板500ul。注意事項：每一步打開細(xì)胞培養(yǎng)時，防止細(xì)胞培養(yǎng)板蓋時勿使細(xì)胞培養(yǎng)板蓋朝上放置。 在將細(xì)胞培養(yǎng)板放于培養(yǎng)箱之前，請噴酒精。 細(xì)胞培養(yǎng)24小時之內(nèi)使用，最好20小時。沿側(cè)壁吸出培養(yǎng)液。1PBS潤洗2次，沿側(cè)壁打入1ml或500ul PBS，輕柔搖勻2-3次后，沿側(cè)壁吸出。 Pfu number/細(xì)胞數(shù)=pfuV/細(xì)胞數(shù)=感染復(fù)數(shù) 感染復(fù)數(shù)為2，加病毒20ul + 480ul SD培養(yǎng)液 感染復(fù)數(shù)為15，加病毒150ul + 480ul SD培養(yǎng)液 病毒滴數(shù)經(jīng)提前測定為1*10-7pfu/ml 先加SD培養(yǎng)基再加病毒。（24h或48h之后進行（10）） 固定細(xì)胞：吸出上清，加4%PFA（組織固定液），1ml/孔，室溫下30min。 PBS洗2次，5min/次，1ml/孔。 細(xì)胞破膜：0.1% Triton in PBS(PBST,T為Triton) ，PBS：Triton=1L：1ml或100ml:0.1ml。1ml/孔，室溫1h。 封閉：5% BSA in PBST（T:0.5%Tween）=BSA + PBST (100ml PBST 中添加5g BSA ) PBST=PBS+Tween(1L PBS中添加500ulTween) BSA 為牛血清白蛋白。1ml/孔，室溫下2h。 一抗：用封閉液按1：100（比例依照抗體說明書）稀釋，300ul/孔，4攝氏度過夜。 PBST（Tween）洗3次，10min/次 。 二抗（4℃抗體熒光抗體）：用PBST（Tween）按1：1000稀釋，300ul/孔，室溫避光1h。 PBST（Tween）洗3次，1ml/孔，10min/次。（18） DPAI ，300ul/孔，室溫避光10分鐘。 PBS 洗2次，1ml/孔，立馬抽出。 載玻片上滴加封片液，細(xì)胞爬片的細(xì)胞層與封片液接觸。 熒光共聚焦顯微鏡觀察。 |
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