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YX科研小助理新蟲 (小有名氣)
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免疫組化（IHC），原來(lái)如此簡(jiǎn)單！
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免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理-抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及相對(duì)定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。 一、原理 根據(jù)抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色原理，組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原先和一抗結(jié)合，再利用一抗與標(biāo)記生物素、熒光素等的二抗進(jìn)行反應(yīng)，前者再用標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AKP)等的抗生物素(如鏈霉親和素等)結(jié)合，最后通過(guò)呈色反應(yīng)或熒光來(lái)顯示細(xì)胞或組織中化學(xué)成分，在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細(xì)胞爬片或組織切片上原位確定某些化學(xué)成分的分布和含量。 二、分類 1、按照標(biāo)記物的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶)、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、免疫酶法、免疫鐵蛋白法、免疫膠體金法及放射免疫自顯影法等。 1）免疫熒光法將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察，當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后會(huì)發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光，從而可以確定組織中的抗原定位或定量。 2）免疫酶標(biāo)法基本原理是先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過(guò)光鏡或電鏡，對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)行定位研究。 3）免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對(duì)蛋白的生物學(xué)活性則沒(méi)有明顯的影響。因此，用膠體金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，就能對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性、定位，甚至定量研究。 由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進(jìn)行光鏡觀察。如應(yīng)用銀加強(qiáng)的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。 2、按染色步驟可分為直接法(又稱一步法)和間接法(二步、三步或多步法)。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。 3、按結(jié)合方式可分為抗原-抗體結(jié)合，如過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶(PAP)法；親和連接，如卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(ABC)法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)(SP)法等，其中SP法是比較常用的方法；聚合物鏈接，如即用型二步法，此方法尤其適合于內(nèi)源性生物素含量高的組織抗原檢測(cè)。 ①免疫組化的原理就是一抗結(jié)合到目標(biāo)蛋白，再有二抗來(lái)進(jìn)行信號(hào)放大。 ②二抗的信號(hào)放大有多種方法，取決于二抗標(biāo)記方法的選擇，簡(jiǎn)單的二抗標(biāo)記方法是直接法，就是直接在二抗上標(biāo)記酶，比如HRP，來(lái)進(jìn)行顯色，這樣的二抗實(shí)際上很便宜，但是缺點(diǎn)就是靈敏度低，好多低豐度的蛋白，結(jié)合不上，免疫組化染出來(lái)的效果就不太好。 ③第二種方法，叫做PAP，比如二抗標(biāo)記了HRP，他們就在孵育二抗后，再孵育一種能結(jié)合HRP的一抗。這種方法靈敏度上去了，但是非特異性增高了。 ④第三種方法被稱為ABC法或者SABC法，主要是在二抗上標(biāo)記生物素，孵育二抗后，加入親和素以及標(biāo)記了HRP的生物素，以這樣的聚合方式，來(lái)進(jìn)行信號(hào)的放大作用。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是能夠成倍提高靈敏度，但同時(shí)也會(huì)提高非特異性，于是就產(chǎn)生了第四種方法，LSAB法標(biāo)記的二抗： 這種方法，直接在親和素上加上HRP標(biāo)記，靈敏度也很高，同時(shí)降低了SABC法的非特異性。而且，LSAB法在實(shí)驗(yàn)的時(shí)一般孵育時(shí)間短(通常就10分鐘)。 ⑤SABC法和LSAB法在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要進(jìn)行內(nèi)源生物素封閉，操作復(fù)雜些，于是產(chǎn)生了第五種標(biāo)記方法，也就是Polymer法，就是在二抗上標(biāo)記聚合的HRP：這樣二抗的信號(hào)就得到了放大，靈敏度也提高了，但Polymer法、SABC法、LSAB法，都不能用于定量實(shí)驗(yàn)，只能用在IHC上。 免疫熒光主流是采用直接法、LSAB法，以及直接標(biāo)記或者LSAB標(biāo)記的三抗來(lái)進(jìn)行信號(hào)放大的�？偨Y(jié)一下，就是直接法的二抗便宜但是靈敏度差；PAP法基本已經(jīng)淘汰，LSAB和SABC法的靈敏度高，但是貴，步驟多；Polymer法靈敏度高，步驟簡(jiǎn)單，但是貴。三、方法 1、SP三步法 a.脫蠟：60℃ 20min；二甲苯I 10min 、二甲苯II 10min。 b.梯度水化：100%EtOH I 5min 、100%EtOH II 5min、95%EtOH 3min、80% EtOH 3min、70% EtOH 3min。 c.滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：3%H₂O₂常溫下避光孵育10min，PBS沖洗3次×3min。 d.抗原修復(fù)：置0.01M枸櫞酸緩沖液(PH 6.0)中用煮沸(微波爐可高火4次×6min)，自然冷卻30min以上，至室溫后PBS沖洗3次×3min。 e.封閉：用封閉液(一般與二抗來(lái)源一致，如正常羊血清工作液)封閉，常溫下10~30min，傾去勿洗。 f.一抗孵育：滴加適宜濃度的一抗4℃冰箱孵育過(guò)夜(最常用)，37℃復(fù)溫45min，PBS沖洗5次×3min(用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照)。 g.二抗孵育：滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30min, PBS沖洗5次×3min。 h.SP反應(yīng)：滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素工作液，37℃孵育30min，PBS沖洗5次×3min。 i.DAB顯色：配置DAB/H₂O₂反應(yīng)液孵育組織切片，鏡下控制染色，一般3~10min，自來(lái)水充分沖洗。 j.蘇木素復(fù)染：一般胞漿蛋白或胞膜蛋白可以適當(dāng)染至幾十秒~幾分鐘，但細(xì)胞核蛋白在幾秒。若過(guò)染，可以用1%HCl褪色。 k.常規(guī)脫水：50% ethanol 1-2min、70% ethanol 1-2min、95% ethanol 1-2min、95% ethanol 1-2min、100% absolute ethanol: (1-2)min、100% absolute ethanol: (1-2)min。 l.透明：Xylene 1×(1-2)min→Xylene 2×(1-2)min； m.封片：中性樹膠。 2、免疫組化的關(guān)鍵環(huán)節(jié) ①脫蠟和水化這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合反應(yīng)。脫蠟可以先60℃20min，然后立即二甲苯1-3分別10min(這個(gè)時(shí)間是由二甲苯新鮮程度和室溫等綜合決定的)，但當(dāng)天制好的切片一般先60℃ 3-4h。水化用梯度乙醇(由高到低)。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。 ②抗原修復(fù)由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過(guò)程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過(guò)抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測(cè)率。常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種(中性的、高pH的等)。 ③滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易收到內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素的干擾，必須用過(guò)氧化氫和卵白素等進(jìn)行滅活。滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶一般3%過(guò)氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以10min左右，而0.3%過(guò)氧化氫則可以適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間，一般10~30min。 用甲醇配置過(guò)氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護(hù)抗原和固定組織作用，過(guò)氧化氫孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易引起脫片；現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4℃避光保存。 ④血清封閉組織切片上有剩余的位點(diǎn)可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽(yáng)性；封閉血清一般是和二抗同一來(lái)源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來(lái)源一致。一般室溫10-30min。但也要防止封閉過(guò)度。 ⑤一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中最重要，包括孵育時(shí)間、溫度和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4℃、室溫、37℃，其中4℃效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37℃1-2h，而4℃過(guò)夜和從冰箱拿出后37℃復(fù)溫45min。 二抗孵育條件：二抗一般室溫或37℃ 30min-1h，而濃度一般有工作液。抗體稀釋液一般就用PBS即可，但專用的抗體稀釋液中除PBS成份外，還加了疊氮化鈉防腐劑、BSA穩(wěn)定劑等組份，對(duì)抗體的多次回收利用較好。 ⑥切片清洗(浸洗、沖洗和漂洗)為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗(延長(zhǎng)時(shí)間和增多次數(shù))尤為重要。 注意：a.單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。b.溫柔沖洗(浸洗方式)，防止切片的脫落。c.沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。d.PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。(中性及弱堿性條件(PH7-8)有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解)。 ⑦DAB顯色背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)而本底著色較淺時(shí)即可沖洗；DAB顯色時(shí)間很短(如幾秒或幾十秒)就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的抗體濃度過(guò)高或抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需要下調(diào)抗體濃度或縮短實(shí)驗(yàn)的抗體孵育時(shí)間。 此外，若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能實(shí)驗(yàn)前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間；DAB顯色時(shí)間很長(zhǎng)(如超過(guò)十幾分鐘)才出現(xiàn)陽(yáng)性染色，一方面可能說(shuō)明實(shí)驗(yàn)者的抗體濃度過(guò)低或孵育時(shí)間過(guò)短(最好一抗4℃過(guò)夜)；另一方面就是封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。 ⑧復(fù)染目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位，經(jīng)常用蘇木素復(fù)染(胞核染料)。注意蘇木素復(fù)染時(shí)間要看當(dāng)時(shí)的室溫、溶液的新舊、目標(biāo)抗原的定位等情況，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘，胞漿蛋白可以適當(dāng)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，而胞核蛋白則要短。 不過(guò)這個(gè)如果染色不理想可以補(bǔ)救的。方法是：染色深則分化時(shí)間稍長(zhǎng)些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。鹽酸酒精是分化，氨水是返藍(lán)。作用不同。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒(一定動(dòng)作要快)后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。 ⑨脫水透明免疫組化對(duì)標(biāo)本處理最后的脫水透明需要采用由低至高的梯度酒精脫水，是避免直接將組織投入高濃度酒精中而造成組織過(guò)度收縮。 ⑩封片為了長(zhǎng)期保存，實(shí)驗(yàn)人員一般用中性樹膠等封片，避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對(duì)面的那個(gè)拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時(shí)為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時(shí)，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會(huì)產(chǎn)生氣泡。四、異常分析 1、非特異性染色①抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。 ②一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體。 ③內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高(含血細(xì)胞多的組織)，需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色。 ④非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果。 ⑤DAB孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度過(guò)高。 ⑥PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤為重要。 ⑦標(biāo)本染色過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。 2、呈陰性結(jié)果①抗體濃度和質(zhì)量問(wèn)題以及抗體來(lái)源選擇錯(cuò)誤。不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng)，必須摸索最佳濃度。 ②抗原修復(fù)不全，對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來(lái)打開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合。 ③組織切片本身這種抗原含量低。 ④血清封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。DAB孵育時(shí)間過(guò)短。 ⑤細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)。五、應(yīng)用 1、臨床應(yīng)用：惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷；確定轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的原發(fā)部位；對(duì)某類腫瘤進(jìn)行進(jìn)一步的病理分型。 2、免疫組化鏡檢：定位抗體的表達(dá)部位(細(xì)胞間質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、核膜、細(xì)胞核等或表達(dá)組織)。 3、細(xì)胞凋亡檢測(cè)：正常凋亡細(xì)胞通過(guò)檢測(cè)凋亡細(xì)胞DNA片段進(jìn)行染色，正常的、人為造成凋亡的細(xì)胞很少能夠被染色。以甲基綠復(fù)染，便于從形態(tài)學(xué)上分辨評(píng)估正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。 |
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