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[交流] 國(guó)自然熱點(diǎn)”巨噬細(xì)胞“和成纖維細(xì)胞聯(lián)合，攻下一區(qū)

MDL的愿景是構(gòu)建一個(gè)開放的知識(shí)生態(tài)系統(tǒng)，不定時(shí)分享高分文獻(xiàn)，讓高質(zhì)量的研究成果能夠觸達(dá)更廣泛的受眾。

今天分享的文獻(xiàn)是2024年3月發(fā)表在Science Advances（IF=11.7）雜志，題為”Modeling mechanical activation of macrophages during pulmonary fibrogenesis for targeted anti-fibrosis therapy”。這篇文章極具創(chuàng)新性，建立共培養(yǎng)的人巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的纖維化微組織模型，研究吡非尼酮在使用預(yù)防性治療、治療性治療和預(yù)處理三種不同的處理方式對(duì)巨噬細(xì)胞和機(jī)械活化的影響并闡明其機(jī)制。

一
研究背景
在纖維化肺組織中，由于收縮性肌成纖維細(xì)胞活躍的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重塑，過(guò)度積累的纖維性膠原經(jīng)常排列成致密束。這種病理上的組織微環(huán)境也為嵌入細(xì)胞提供了地形線索，導(dǎo)致細(xì)胞功能的變化，如它們的形態(tài)和排列。為了簡(jiǎn)單起見，在體外產(chǎn)生的CD206陽(yáng)性巨噬細(xì)胞通常被稱為M2表型。吡非尼酮（PFD）是美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的抗纖維化藥物，作用于多種纖維化途徑。PFD減少成纖維細(xì)胞增殖，抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）途徑。最近的研究表明，PFD還可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化和纖維化活性，但由于這些研究是在動(dòng)物模型中進(jìn)行的，因此尚不清楚這些發(fā)現(xiàn)是否適用于人類。缺乏與人類相關(guān)的、模擬疾病的研究模型一直是抗纖維化藥物開發(fā)的主要障礙之一。

二
研究思路

通過(guò)對(duì)人纖維化肺樣本的組織學(xué)和單細(xì)胞測(cè)序分析，我們發(fā)現(xiàn)纖維化巨噬細(xì)胞在纖維化肺微環(huán)境中被機(jī)械激活。我們用共培養(yǎng)的人巨噬細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞的模擬巨噬細(xì)胞的纖維化微組織模型，原纖維化巨噬細(xì)胞被植入到這個(gè)組織中被機(jī)械激活，它們與膠原纖維和成纖維細(xì)胞的廣泛共排列促進(jìn)了肺微組織中廣泛的纖維形成。PFD治療破壞了M2巨噬細(xì)胞的極化和機(jī)械活化，導(dǎo)致纖維化抑制。我們發(fā)現(xiàn)PFD通過(guò)抑制整合素αMβ2（CD11b/CD18）和Rhoassociated kinase 2（ROCK2）來(lái)抑制巨噬細(xì)胞的機(jī)械激活，這是PFD的一個(gè)未知的作用機(jī)制。總之，這些結(jié)果揭示了一種以前未確定的機(jī)制，通過(guò)這種機(jī)制，機(jī)械激活的巨噬細(xì)胞在組織水平上促進(jìn)肺纖維化。異質(zhì)細(xì)胞力傳感顯微組織模型是研究免疫-基質(zhì)細(xì)胞復(fù)雜相互作用和抗纖維化藥物作用機(jī)制的有力工具

三
結(jié)果

1. 巨噬細(xì)胞對(duì)地形控制的組織重塑有機(jī)械反應(yīng)

為了解巨噬細(xì)胞如何對(duì)纖維化肺組織中所見的重塑組織結(jié)構(gòu)做出反應(yīng)，研究人員創(chuàng)建具有控制形態(tài)和細(xì)胞與ECM對(duì)齊的工程微組織。將正常人肺成纖維細(xì)胞（NHLFs）與I型膠原混合，并將其植入微孔中，微孔中含有一組按拓?fù)淠Ｊ脚帕械奈⒅�。圖案設(shè)計(jì)包括螺旋圖案、菱形圖案和方形圖案，以模擬肺組織中的各種幾何形狀，如高度彎曲的肺泡壁。成纖維細(xì)胞產(chǎn)生收縮力，使膠原ECM緊貼微柱。作為成纖維細(xì)胞介導(dǎo)的ECM重塑的結(jié)果，形態(tài)學(xué)控制的微組織按照微柱陣列模式模板形成。微組織中的NHLF和膠原纖維沿著微柱邊界條件定義的張力線強(qiáng)烈共排列。因此，控制細(xì)胞和ECM纖維排列提供一個(gè)機(jī)會(huì)來(lái)觀察到組織地形的反應(yīng)。接下來(lái)，將來(lái)自人外周血的單核細(xì)胞用白細(xì)胞介素-4（IL-4）和IL-13進(jìn)行預(yù)極化，然后將其植入NHLF重建的顯微組織中。這些M2巨噬細(xì)胞在48小時(shí)內(nèi)粘附在顯微組織表面，呈與膠原纖維和NHLF對(duì)齊的細(xì)長(zhǎng)紡錘形形態(tài)。共聚焦成像顯示，巨噬細(xì)胞至少部分穿透微組織，并與周圍的膠原纖維和NHLF在三維上相互作用，如膠原纖維和巨噬細(xì)胞重疊所示。在沿螺旋形微組織高度彎曲邊緣排列的細(xì)長(zhǎng)巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到強(qiáng)表達(dá)整合素β2（CD18），提示巨噬細(xì)胞與周圍膠原纖維和NHLFs之間的相互作用涉及機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些發(fā)現(xiàn)表明，M2巨噬細(xì)胞在纖維化樣組織微環(huán)境中具有感知地形信號(hào)的能力，并根據(jù)這些信號(hào)動(dòng)態(tài)調(diào)整其機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

2. 巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間的廣泛共排列促進(jìn)了工程微組織中廣泛的纖維化反應(yīng)

接下來(lái)，研究人員試圖探究在巨噬細(xì)胞-NHLF共培養(yǎng)的微組織中，纖維化巨噬細(xì)胞如何促進(jìn)纖維化的形成。將纖維化的M2巨噬細(xì)胞引入到NHLF填充的微組織表面。共培養(yǎng)3天后，在微組織中觀察到α-SMA的高表達(dá)，表明NHLF激活到肌成纖維細(xì)胞。M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的微組織中α-SMA的表達(dá)水平明顯高于僅NHLF的微組織（4.7倍），但略低于TGF-β1處理的陽(yáng)性對(duì)照。由于分化的肌成纖維細(xì)胞已顯示出產(chǎn)生高收縮力，研究人員使用原位微柱力傳感器測(cè)量單培養(yǎng)和共培養(yǎng)微組織中產(chǎn)生的收縮力。與NHLF單獨(dú)培養(yǎng)的微組織相比，M2巨噬細(xì)胞與NHLF共培養(yǎng)的微組織產(chǎn)生的收縮力高5.7倍。當(dāng)單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞單獨(dú)接種膠原基質(zhì)時(shí)，它們不能致密化膠原并形成微組織，這表明這些細(xì)胞缺乏收縮力的產(chǎn)生。與收縮力測(cè)量類似，巨噬細(xì)胞-成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的微組織上清中活性TGF-β水平高于NHLF單培養(yǎng)的微組織，提示旁分泌TGF-β信號(hào)在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的組織纖維化中的潛在作用。由于早期研究表明巨噬細(xì)胞對(duì)成纖維細(xì)胞的激活主要發(fā)生在近距離，因此我們?cè)诠才囵B(yǎng)的微組織中檢測(cè)兩種細(xì)胞的作用情況。在高顯微鏡分辨率下可觀察到單個(gè)巨噬細(xì)胞接近和/或直接接觸肌成纖維細(xì)胞。TGF-β免疫染色顯示TGF-β信號(hào)與CD206共定位，而與α-SMA不共定位，提示這些TGF-β由巨噬細(xì)胞分泌并沉積到ECM中。

3. PFD抗纖維化治療對(duì)巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的纖維化有作用

PFD和尼達(dá)尼布是FDA批準(zhǔn)的治療肺纖維化的唯一藥物，兩者在纖維化組織中的作用模式和細(xì)胞靶點(diǎn)都不明確。研究人員構(gòu)建的巨噬細(xì)胞-NHLF共培養(yǎng)微組織（MaFiCo）是研究抗纖維化藥物作用的一個(gè)很好的纖維化模型。作為一種范例藥物，研究人員將PFD應(yīng)用于我們的顯微組織模型，使用（i）預(yù)防性治療，（ii）治療性治療和（iii）預(yù)處理。這些不同方案的目的是研究PFD在沒(méi)有預(yù)先存在的纖維化狀況（預(yù)防性治療）或預(yù)先存在的纖維化狀況（治療性治療）下的作用。在預(yù)防性治療中，將PFD與巨噬細(xì)胞一起引入到NHLF填充的微組織中，并在共培養(yǎng)中維持3天。與未處理的對(duì)照組相比，在濃度為10和1000 μg/ml時(shí)，預(yù)防性PFD治療顯著降低粘附的巨噬細(xì)胞數(shù)量，NHLFs中α-SMA表達(dá)量分別降低80%和95%，微組織收縮力分別降低90%和144%。10 μg/ml的PFD對(duì)培養(yǎng)上清中的活性TGF-β沒(méi)有明顯抑制作用，但在1000 μg/ml的濃度下，活性TGF-β水平降低62%。這些結(jié)果表明，在臨床相關(guān)濃度（10 μg/ml）下，預(yù)防性PFD治療已能有效抑制幾種促纖維化因子。在最高濃度為1000 μg/ml時(shí)，PFD幾乎完全消除巨噬細(xì)胞對(duì)微組織表面的粘附、NHLF中α-SMA的表達(dá)、ECM中沉積的TGF-β和微組織中纖維連接蛋白的表達(dá)。在這種情況下，少數(shù)剩余的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出超細(xì)長(zhǎng)的形狀，這與未經(jīng)治療的對(duì)照組的紡錘體形狀明顯不同。由于在預(yù)防性治療中，微組織不具有預(yù)先存在的纖維化特征，這些結(jié)果表明，破壞巨噬細(xì)胞對(duì)微組織的粘附抑制纖維化的發(fā)展。

在治療方案中，巨噬細(xì)胞與NHLF共培養(yǎng)3天形成纖維化微組織，然后再引入PFD 3天。與未處理的對(duì)照顯微組織相比，PFD治療僅適度減少附著的巨噬細(xì)胞數(shù)量（40%），NHLFs中α-SMA表達(dá)（47.5%），以及上清中活性TGF-β水平。PFD處理下顯微組織收縮力的變化不顯著。此外，PFD處理導(dǎo)致粘附的巨噬細(xì)胞形態(tài)從紡錘形到絲狀，發(fā)生顯著變化，這在預(yù)防性治療中可以看到。然而，與預(yù)防治療相比，治療治療中更多的巨噬細(xì)胞仍然粘附。

由于PFD治療同時(shí)影響巨噬細(xì)胞和NHLF，研究人員接下來(lái)用PFD預(yù)處理巨噬細(xì)胞，以消除其對(duì)這兩種細(xì)胞類型的影響。首先用巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）處理人外周血源性單核細(xì)胞，然后加入PFD處理24小時(shí)，再用IL-4/IL-13誘導(dǎo)M2極化24小時(shí)。在誘導(dǎo)的M2極化過(guò)程中加入PFD可以抑制CD206的表達(dá)，并以劑量依賴的方式降低巨噬細(xì)胞單培養(yǎng)上清中的活性TGF-β水平，而不影響細(xì)胞活力或塑料培養(yǎng)皿上的粘附。然后將這些預(yù)處理的巨噬細(xì)胞接種到NHLF填充的微組織中，并在不進(jìn)一步添加PFD的情況下維持。共培養(yǎng)3天后，在10和1000 μg/ml的PFD預(yù)處理下，粘附的巨噬細(xì)胞數(shù)量分別減少59%和72%，NHLFs中α-SMA的表達(dá)分別減少80%和93%，顯微組織收縮力分別減少100%，活性TGF-β水平分別減少了35%和50%。綜上所述，這些結(jié)果表明PFD既抑制巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的M2極化，也抑制巨噬細(xì)胞粘附于NHLF填充的顯微組織的能力。由于這兩種功能都與巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的纖維化有關(guān)，PFD可能作用于巨噬細(xì)胞，影響它們對(duì)纖維化過(guò)程的貢獻(xiàn)。

4. PFD通過(guò)抑制ROCK2和整合素αMβ2抑制巨噬細(xì)胞的機(jī)械活化

PFD治療降低巨噬細(xì)胞在顯微組織上附著、排列和擴(kuò)散的能力，這些都是依賴于細(xì)胞粘附的細(xì)胞功能。反過(guò)來(lái)，M2極化已被證明需要強(qiáng)粘附和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架重組。同時(shí)，研究人員在已發(fā)表的IPF患者肺巨噬細(xì)胞scRNA-seq數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)與機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程相關(guān)的上調(diào)基因，如細(xì)胞-基質(zhì)粘附、整合素介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。在這些基因中，RAS同源家族成員A（RHOA），ITGAM和高度上調(diào)的基因都與細(xì)胞-基質(zhì)粘附和整合素介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)。因此，一研究人員將重點(diǎn)放在RhoA相關(guān)通路、αM整合素和β2整合素上，以研究PFD是否通過(guò)作用于巨噬細(xì)胞的機(jī)械感知和激活來(lái)抑制纖維形成。Rho相關(guān)激酶ROCK1和ROCK2是RhoA的主要下游效應(yīng)物，ROCK2在抗纖維化藥物KD025的臨床試驗(yàn)中被用作治療靶點(diǎn)。共培養(yǎng)微組織中ROCK2免疫染色顯示，ROCK2主要在M2巨噬細(xì)胞中表達(dá)。在預(yù)防和治療兩種治療方案中，PFD治療導(dǎo)致ROCK2表達(dá)分別降低65%和74%。接下來(lái)，用ROCK2特異性抑制劑KD025處理共培養(yǎng)的微組織，以確定對(duì)巨噬細(xì)胞機(jī)械激活的抑制是否是ROCK2特異性的。結(jié)果顯示，KD025在預(yù)防性和治療性治療中分別導(dǎo)致ROCK2表達(dá)降低39%和21%，同時(shí)粘附的巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著減少（預(yù)防性75%，治療性67%），巨噬細(xì)胞形態(tài)從紡錘形轉(zhuǎn)變?yōu)榻z狀，活性TGF-β顯著降低（預(yù)防組62%，治療組15%）。為確定上述作用是否對(duì)巨噬細(xì)胞具有特異性，研究人員在硅膠基質(zhì)（剛度為4 MPa）上對(duì)單培養(yǎng)M2巨噬細(xì)胞進(jìn)行PFD和KD025處理。如附屬圖所示，PFD處理和KD025處理顯著降低ROCK2的表達(dá)，同時(shí)巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，活性TGF-β減少40%和35%，表明ROCK2途徑的抑制是M2巨噬細(xì)胞特異性的。接下來(lái)，研究人員檢測(cè)αM和β2整合素在共培養(yǎng)顯微組織中的表達(dá)。免疫染色顯示這些整合素僅在M2巨噬細(xì)胞中表達(dá)。在預(yù)防和預(yù)處理方案中，PFD治療導(dǎo)致αM和β2整合素亞基的表達(dá)分別減少64%和83%。為確定這種作用是否對(duì)巨噬細(xì)胞具有特異性，對(duì)單培養(yǎng)的M2巨噬細(xì)胞進(jìn)行PFD治療。在單一栽培中，PFD處理也顯著降低αM和β2整合素的表達(dá)。由于RhoA/ROCK信號(hào)通路影響整合素的表達(dá)，研究人員也使用KD025處理M2巨噬細(xì)胞單培養(yǎng)。KD025抑制ROCK2顯著降低αM和β2整合素的表達(dá)。綜上所述，PFD對(duì)巨噬細(xì)胞包括ROCK2、αM和β2整合素在內(nèi)的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有抑制作用，其作用與ROCK2選擇性抑制劑KD025相似。

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