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[交流]
重組pPIC9K質(zhì)粒構(gòu)建及GS115酵母表達
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本人目前剛開始做畢赤酵母表達，實驗室沒有相關(guān)背景，很多地方不明白，希望各路大神指點 1、我已經(jīng)構(gòu)建好重組質(zhì)粒，但是現(xiàn)在有點不確定構(gòu)建是否有問題：我的目的基因插入在5‘a(chǎn)ox1及a- factor后面，但是我把原本a- factor后面，taa之前，的30bp刪去了，不知有沒有影響 2、在線性化酶切時，酶切效率很低，50ul體系，其中dna 4ul（約4ug），酶1ul，37度酶切1h，用的是takara的快切酶，怎樣能提高酶切效率呢，是需要加大酶量還是延長酶切時間？ 3、電轉(zhuǎn)之后轉(zhuǎn)化子特別少，電轉(zhuǎn)參數(shù)3kv，6ms，請問怎么才能提高轉(zhuǎn)化率？ 4、實驗室搖床只能達到200rpm，手冊上推薦220-250rpm，請問轉(zhuǎn)速低會不會影響表達？ 5、搖瓶發(fā)酵階段需不需要控制ph？我是初始ph為5.0，用的是bmmy培養(yǎng)基 6、我用的載體ppic9k按理說是分泌表達，但是我分析發(fā)酵上清，發(fā)現(xiàn)目的蛋白表達量特別低，之前用的是單拷貝菌株，會不會是因為這個呢？還是說有可能沒有分泌出來，需要破胞分析一下？ 本人菜鳥階段問題有點多，感謝各位賜教！！ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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