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望風止水新蟲 (小有名氣)
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大腸桿菌原核表達，破碎后目的蛋白看不到了 已有1人參與
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一直在做蛋白的原核表達與純化，目前遇到的一個問題，不知道大家有何建議？ 我們在E.coli BL21(DE3)中做目的基因的克隆表達，過程是：OD值 0.8左右加入IPTG(終濃度0.5mM），25℃誘導24h后取2mL離心取沉淀，加100μL PBS和50μL 上樣液煮沸10min，取30μL跑SDS-PAGE。剩余的菌液離心后加入含8M尿素的binding buffer（因為懷疑目的蛋白在包涵體里面），然后超聲破碎（200w，工作4S，間隔6S，工作20min）。破碎后13000rpm離心10min，上清保留做SDS-PAGE，沉淀用PBS洗3遍后加入binding buffer，取相同的兩管，1管加上樣液煮沸10min做SDS-PAGE，1管不煮沸直接做做SDS-PAGE，結(jié)果。直接菌液煮沸后看到了比較明顯的目的條帶（我同時做了2個目的蛋白，1個14 kDa左右，另1個35kDa左右），而后面幾個處理的目的條帶很弱，基本看不到，不知道怎么回事？ SDS-PAGE的圖片請查看鏈接: https://pan.baidu.com/s/1OAXXo0UxW8UfisBtNkL5tA?pwd=k861 提取碼: k861 |
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望風止水
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yandz680717
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3樓2024-09-05 15:11:08
望風止水
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4樓2024-09-05 19:39:18
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