 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1249 | 回復(fù): 0 | |||
YX科研小助理新蟲 (小有名氣)
|
[交流]
熒光素酶表達(dá)的淋巴瘤NCG小鼠模型的構(gòu)建
|
|
淋巴瘤是發(fā)生在淋巴結(jié)及或淋巴結(jié)外淋巴組織的惡性腫瘤，可分為霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤，在青壯年中發(fā)病率比較高。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，目前全球每年約有35萬新發(fā)淋巴瘤患者，死亡患者人數(shù)超過20萬。我國淋巴瘤發(fā)病率為0.02‰，每年新增患者約2.5萬人，死亡2萬人。淋巴瘤已經(jīng)嚴(yán)重威脅人類健康，建立合適的動物模型是研制抗腫瘤藥和了解血液腫瘤發(fā)展的重要手段。 動物的選擇NCG免疫缺陷小鼠為人源化小鼠模型，此品系缺失成熟的T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞，可以用來移植人類造血干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞。選用NOD-Prkdcem26Cd52（上標(biāo)）Il2rgem26Cd22（上標(biāo)）/Nju(NCG)免疫缺陷小鼠。造模方法1表達(dá)熒光素酶慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建以慢病毒質(zhì)粒lentiCRISPRv2作為骨架載體，lentiCRISPRv2質(zhì)粒原表達(dá)框架為cas9及共表達(dá)的嘌呤霉素，將表達(dá)cas9的序列通過分子生物學(xué)手段替換成表達(dá)熒光素酶的基因序列，即可得到熒光素酶與嘌呤霉素共表達(dá)的病毒包裝質(zhì)粒。對lentiCRISPRv2進行XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切去除cas9表達(dá)框，酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖膠跑膠回收10000bp處條帶，利用Addgene設(shè)計引物lentiCRISPRv2-luc+-F(5’-GAACACAGGACCGGTTCTAGAGCGCTGCCACCATGGAAGACGCCAAAAAC-3’)和引物lentiCRISPRv2-luc+-R(5’-GAAGTTTGTTGCGCCGGATCCACACGGCGATCTTTCCGC-3’)，以PLG-3 basic為模板，采用 PhantaMaxmastermixPCR擴增熒光素酶基因片段。ONEstepCloneKit(Vazyme)將lentiCRISPRv2膠回收產(chǎn)物和 PCR產(chǎn)物進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coli DH5α大腸桿菌感受態(tài)，帶氨芐青霉素的Luria-Bertani(LB)平板上篩選轉(zhuǎn)化子，用引物lentiCRISPRv2-luc+-F 和lentiCRISPRv2luc+-R對轉(zhuǎn)化子進一步篩選，并通過測序進一步驗證，通過Snapgene進行序列比對，陽性克隆命名為lentiCRISPRv2-luc+。2慢病毒的包被、濃縮HEK293T細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37℃恒溫，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇生長狀態(tài)良好的HEK293T細(xì)胞，于10cm培養(yǎng)皿接種約4×1000000胞，12~16h后達(dá)到70%~80%融合率。在一個無菌的5mL試管中，加入無血清Opti-DMEM培養(yǎng)基1.5mL，依次加入12.5μg的lentiCRISPRv2-luc+、10μgVSVG和7.5μgΔ8.91 3種質(zhì)粒，輕輕混勻。在另一個無菌的5mL試管中，將60μL聚乙烯亞胺(PEI)(1ng/μL)稀釋于1.5mL無血清Opti-DMEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫放置5min。將稀釋好的PEI緩慢加入混勻的質(zhì)粒中，混勻，室溫孵育20min，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，逐滴加入培養(yǎng)皿中，8h后換成完全培養(yǎng)基。收集轉(zhuǎn)染后48h和72h的病清，4℃，4000r/min離心30min去除細(xì)胞碎片，并用0.45μm濾膜過濾，進一步去除細(xì)胞碎片；4℃條下，25000r/min超速離心2h，保留沉淀，利用RPMI1640培養(yǎng)基溶解沉淀即為濃縮病毒，將病毒分裝，立即使用或凍存于-80℃?zhèn)溆谩?慢病毒滴度的測定實時熒光定量PCR(RealtimeQuantitativePCR，qPCR)法測定慢病毒的滴度，以lenti-luc+大抽質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，測定標(biāo)準(zhǔn)曲線:利用阿佛加德羅定律推論，將lentiCRISPRv2-luc+逐級稀釋成1010，109，108，107，106，105，104，103，100，10，0個拷貝等梯度濃度，每個梯度重復(fù)3次，設(shè)計引物:WPRE-F(5’-GGCACTGACAATTCCGTGGT-3’)和 WPRE-R(5’-AGGGACGTAGCAGAAGGACG-3’)，以逐級稀釋好的質(zhì)粒為模板，qPCR測定拷貝數(shù)和Ct值之間的相關(guān)性，并擬合成直線。吸取混勻的病毒，抽提病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以 WPRE-F和 WPRE-R為qPCR引物，測定Ct值，利用已經(jīng)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出病毒拷貝數(shù)。由于病毒顆粒與病毒拷貝數(shù)一一對應(yīng)，即可計算出病毒的滴度。4嘌呤霉素最佳篩選濃度的確定取對數(shù)生長期Raji細(xì)胞，按每孔5×105個接種于6孔板中，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。嘌呤霉素按0，0.5，1，1.5，2，3μg/mL設(shè)置6個濃度梯度。在細(xì)胞接種24h后，將配制好的嘌呤霉素加入96孔板中，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)孔，每天觀察細(xì)胞生長情況，在48h內(nèi)全部死亡的最低嘌呤霉素濃度，即為篩選表達(dá)熒光素酶的Raji克隆細(xì)胞的濃度。5慢病毒對Raji細(xì)胞的感染，陽性細(xì)胞的篩選及擴增取對數(shù)生長期的Raji細(xì)胞5×105接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，加入濃縮后的病毒，以感染復(fù)數(shù)(MultiplicityOfInfection，MOI)=5感染Raji細(xì)胞，并加入終濃度為8μg/mL的polybrene，加入1mLRPMI1640完全培養(yǎng)基，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中靜置感染24h后換成含10%胎牛血清的 RPMI1640新鮮完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24~48h，培養(yǎng)基變黃時，更換新鮮培養(yǎng)基。向慢病毒感染后72h的Raji細(xì)胞中加入合適濃度的嘌呤霉素，每兩天更換一次培養(yǎng)基并維持嘌呤霉篩選直至得到陽性混合細(xì)胞。取1×10000個細(xì)胞加入熒光素酶底物，初步鑒定熒光素酶的表達(dá)；將嘌呤霉素篩選濃度提升到3倍，篩選熒光素酶高表達(dá)陽性克隆細(xì)胞，命名為Raji-luc+。6熒光素酶活性鑒定將Raji-luc+細(xì)胞傳代5~10次，收集一定量細(xì)胞，按梯度稀釋于96孔板中，每孔 Raji-luc+細(xì)胞數(shù)分別為2×104，1×104，5000，2500，1250，625，312，0個，用熒光素酶底物(Promega)，酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞發(fā)光情況，檢測細(xì)胞發(fā)光強度和細(xì)胞數(shù)之間的相關(guān)性；進一步使用活體成像對每孔Raji-luc+細(xì)胞數(shù)分別為4×104，2×104，1×104，5000，2500，1250，625個及4×104個Raji細(xì)胞的96孔板成像。7NCG小鼠血液腫瘤模型的建立隨機將4~5周，體重15~20g，5只雌性NCG小鼠分成兩組，空白對照(mock)組小鼠，實驗組小鼠(n=4)每只尾靜脈注射 Raji-luc+細(xì)胞1×106個。實驗組取對數(shù)生長期的Raji細(xì)胞，用PBS重懸細(xì)胞密度為1×107/mL，實驗組每只小鼠尾靜脈注射100μL；mock組尾靜脈注射100μLPBS，接種后第0d，9d，12d，15d，活體成像儀檢測腫瘤成瘤情況。檢測前使用戊巴比妥鈉麻醉小鼠(計量為35mg/kg)，嚴(yán)格按照Promega說明書注射底物，10min內(nèi)，進行活體成像分析腫瘤生長情況，并繪制小鼠體重變化曲線。結(jié)果01lentiCRISPRv2-luc+質(zhì)粒的構(gòu)建以lentiCRISPRv2-luc+為載體骨架，將熒光素酶表達(dá)基因插入其中，轉(zhuǎn)入E.coli DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽性轉(zhuǎn)化子。熒光素酶通過P2A與嘌呤霉素基因相連，EF1-α啟動熒光素酶和嘌呤霉素的共表達(dá)。02慢病毒滴度的測定以lentiCRISPRv2-luc+質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋成每孔1×107，1×106，1×105，1×104，1×103，1×102，10，0個拷貝梯度濃度，每個梯度濃度重復(fù)3個孔，QPCR測定拷貝數(shù)對應(yīng)的Ct值，分析拷貝數(shù)和Ct值成對數(shù)相關(guān)性，R2=0.9985，擬合成方程為:y=-1.535ln(x)+35.453，y代表Ct值，x代表拷貝數(shù)。抽取病毒總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，重復(fù)3個孔，測得 Ct為26.78，計算拷貝數(shù)為211，稀釋倍數(shù)為1×105，計算出病毒滴度為2×107/mL。03Raji陽性細(xì)胞的篩選和穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的Raji細(xì)胞系的鑒定經(jīng)嘌呤霉素梯度濃度篩選，確定篩選Raji細(xì)胞的最佳嘌呤霉素篩選濃度為2μg/mL，慢病毒感染Raji細(xì)胞后經(jīng)2μg/mL的嘌呤霉素篩選1周后，細(xì)胞不再死亡，開始正常生長；將嘌呤霉素濃度提升至6μg/mL，篩選出高表達(dá)熒光素酶的Raji細(xì)胞混合克隆，在含6μg/mL的RPMI1640完全培養(yǎng)基中繼續(xù)擴大培養(yǎng)并傳代，至第5代時利用熒光素酶活性檢測。嘌呤霉素的篩選濃度從2μg/mL提升至6μg/mL，Raji細(xì)胞熒光素酶表達(dá)量提升約2倍，Raji-luc+細(xì)胞系熒光素酶的高表達(dá)有利于在小鼠體內(nèi)靈敏的追蹤腫瘤形成或消除。在96孔板中，用RPMI1640培養(yǎng)基將Raji-luc+細(xì)胞進行倍比稀釋，從10000/孔到160/孔，用培養(yǎng)基作為陰性對照(mock)，加入熒光素酶底物，酶標(biāo)儀檢測和收集數(shù)據(jù)，發(fā)光強度與細(xì)胞數(shù)量成正比，可以依據(jù)發(fā)光強度的大小來判斷腫瘤細(xì)胞的多少。取相同梯度稀釋的細(xì)胞加入熒光素酶底物，最后一個孔為RPMI1640培養(yǎng)基，作為陰性對照。體外活體成像儀顯示，Raji-luc+細(xì)胞具有良好的成像功能，當(dāng)細(xì)胞數(shù)只有625個時，依然能檢測到信號值，且從圖像顯示的亮度可以看出發(fā)光強度與細(xì)胞數(shù)成正比。（活體成像技術(shù)是一種高靈敏度而直觀的影像技術(shù)，能夠準(zhǔn)確地觀察經(jīng)熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞體內(nèi)定位、增殖及轉(zhuǎn)移情況。其優(yōu)勢在于：熒光素酶標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)成瘤后，利用靈敏的活體成像系統(tǒng)，檢測熒光素的發(fā)光強度，可間接反映出小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量、大小和轉(zhuǎn)移情況。因此活體成像技術(shù)是篩選抗腫瘤藥物和評價抗腫瘤藥物有效性的新興手段。） 活體成像儀04穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的Raji細(xì)胞系生長特性細(xì)胞計數(shù)觀察Raji-luc+細(xì)胞和母細(xì)胞Raji細(xì)胞的生長情況。Raji-luc+細(xì)胞和Raji細(xì)胞具有相似的生長趨勢，表明Raji-luc+細(xì)胞熒光素酶的過表達(dá)并未影響細(xì)胞生長周期。分別取1×104第5，6，7，8，9，10代的Raji-luc+細(xì)胞，加入熒光素酶底物，發(fā)光強度隨著代數(shù)的增加，保持穩(wěn)定，熒光素酶基因能在細(xì)胞生長分裂過程中穩(wěn)定表達(dá)。05淋巴瘤NCG小鼠模型的建立NCG小鼠尾靜脈注射Raji-luc+細(xì)胞，移植后9d，所有實驗組均可觀察到腫瘤發(fā)光，mock組未觀察到發(fā)光，隨著時間增加，移植后12d，實驗組發(fā)光強度明顯增強，第14天，腫瘤負(fù)荷小鼠開始死亡，小鼠全身腫瘤擴散，觀察小鼠腫瘤分布，發(fā)現(xiàn)小鼠頭部和淋巴處腫瘤集中。NCG小鼠腫瘤模型建立過程中，尾靜脈注射Raji-luc+細(xì)胞后7d之內(nèi)，小鼠體重呈小幅增長的趨勢，但隨著腫瘤負(fù)荷的增大，小鼠體重快速下降，直至死亡。 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
環(huán)境工程學(xué)碩288求助調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
291求調(diào)劑
已經(jīng)有7人回復(fù)
-
復(fù)試調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
學(xué)碩材料275調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
26申博 求博導(dǎo)
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
293求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
環(huán)境調(diào)劑
已經(jīng)有8人回復(fù)
-
中國林科院林化所（南京）2026年招收化學(xué)/材料/環(huán)境工程等背景碩士研究生3名
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
306求調(diào)劑
已經(jīng)有7人回復(fù)
-
0703化學(xué) 學(xué)碩 理工科均可 不區(qū)分研究方向 總分279求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 YX科研小助理 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 環(huán)境工程學(xué)碩288求助調(diào)劑 +6 | 多吃億口芝士 2026-03-02 | 6/300 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 學(xué)碩材料275調(diào)劑 +3 | 路三三 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工調(diào)劑 280分 +10 | yyqqhh 2026-03-03 | 10/500 |
|
|
|
[碩博家園] 2025屆雙非化工碩士畢業(yè)，申博 +4 | 更多的是 2026-02-27 | 5/250 |
|
|
|
[基金申請] 沒有青基直接申請面上，感覺自己瘋了 +5 | kevin63t 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
[考研] 成績276，專業(yè)代碼0856求調(diào)劑 +7 | 小陳朵 2026-03-03 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 283求調(diào)劑 +9 | 鹿沫笙 2026-03-02 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 化工專碩348，一志愿985求調(diào)劑 +8 | 弗格個 2026-02-28 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 290分材料工程085601求調(diào)劑 數(shù)二英一 +8 | llx0610 2026-03-02 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 0856材料調(diào)劑 +5 | 沿岸有貝殼OUC 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料284求調(diào)劑，一志愿鄭州大學(xué)英一數(shù)二專碩 +15 | 想上岸的土撥鼠 2026-02-28 | 15/750 |
|
|
|
[考研] 302材料工程求調(diào)劑 +5 | Doleres 2026-03-01 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿中石油（華東）本科齊魯工業(yè)大學(xué) +3 | 石能偉 2026-03-02 | 3/150 |
|
|
|
[考博] 誠招農(nóng)業(yè)博士 +3 | 心欣向榮 2026-02-28 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 291 求調(diào)劑 +3 | 化工2026屆畢業(yè)?/a> 2026-03-02 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 292求調(diào)劑 +7 | yhk_819 2026-02-28 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 材料調(diào)劑 +6 | 愛擦汗的可樂冰 2026-02-28 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 322求調(diào)劑 +3 | 熊境喆 2026-03-01 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 化工299分求調(diào)劑 一志愿985落榜 +5 | 嘻嘻(*^ω^*) 2026-03-01 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +6 | 曼殊2266 2026-02-28 | 7/350 |
|