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[交流] 干貨分享 | PCR實(shí)驗(yàn)，需要哪些組分/條件，值得收藏！

一、PCR反應(yīng)組分

1.模板DNA：來源比較廣，用于復(fù)制的PCR模板可以是任何DNA來源，如基因組DNA（gDNA）、互補(bǔ)DNA（cDNA）和質(zhì)粒DNA。不過，DNA的組成或復(fù)雜度會(huì)影響PCR擴(kuò)增的最佳起始量。例如，在起始量為50µL 的PCR中，只需0.1–1 ng質(zhì)粒DNA，而gDNA則需要5–50ng。最佳模板起始量還取決于所使用的 DNA 聚合酶類型；經(jīng)過改造的DNA聚合酶對(duì)模板的親和力更強(qiáng)，靈敏度更高，所需的DNA起始量更少。對(duì)DNA起始量的優(yōu)化很重要，因?yàn)槠鹗剂窟^高會(huì)增加發(fā)生非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)，而起始量過低會(huì)降低得率。
有時(shí)候，PCR實(shí)驗(yàn)方案會(huì)使用拷貝數(shù)表示DNA起始量，特別是gDNA。拷貝數(shù)的計(jì)算取決于分子的數(shù)量，即DNA起始摩爾量。用Avogadro常數(shù)（L）和摩爾質(zhì)量計(jì)算拷貝數(shù)，公式如下：
拷貝數(shù)=L×摩爾數(shù)=L×（總質(zhì)量/摩爾質(zhì)量）
特定DNA鏈的摩爾質(zhì)量取決于其大小或總堿基數(shù)（即其長(zhǎng)度和單鏈或雙鏈特性的組合）。
理論上，單拷貝DNA或單個(gè)細(xì)胞在理想條件下足夠用于PCR擴(kuò)增。但在實(shí)際情況中，特定模板量的擴(kuò)增效率很大程度上取決于反應(yīng)組分和反應(yīng)參數(shù)，以及DNA聚合酶的靈敏度。
除了gDNA、cDNA和質(zhì)粒DNA，可通過再次擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，得到更高的目標(biāo)DNA得率。盡管未純化的PCR產(chǎn)物可以直接再次用作模板，但是引物、dNTP、鹽和副產(chǎn)物等遺留反應(yīng)成分會(huì)對(duì)擴(kuò)增造成不利影響。為了避免這種抑制作用，通常建議在下一輪PCR前用水稀釋反應(yīng)。如需獲取最佳結(jié)果，應(yīng)在再次擴(kuò)增前將PCR擴(kuò)增子進(jìn)行純化。
模板DNA的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組分，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
2.脫氧核苷三磷酸（dNTP）：四種dNTP（dATP、dCTP、dGTP和dTTP）是PCR原料，其比例和濃度與PCR密切相關(guān)。dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)用1M NaOH或1M Tris配成高濃度后，HCI的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200 μmol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。但是，在某些情況下，如通過PCR方法進(jìn)行隨機(jī)突變，偶爾也會(huì)使用濃度不等的dNTP，以促進(jìn)非校正DNA聚合酶產(chǎn)生更多的錯(cuò)誤堿基插入。
dNTP儲(chǔ)存液：dNTP溶于pH為7.0的NaOH貯存液中，最初的貯存液可稀釋到10mol/L，分裝后存放在-20℃冰箱中。dNTP使用濃度在20～200μmol/L之間。4種dNTP必須等濃度配合以減少錯(cuò)配誤差。
dNTP使用濃度：在PCR反應(yīng)中，使用低dNTP濃度，可減少非靶位置啟動(dòng)和延伸時(shí)的核苷酸錯(cuò)誤摻入。在常見的PCR應(yīng)用中，各種dNTP的常用終濃度通常為0.2mM。一般可根據(jù)靶序列的長(zhǎng)度和組成來決定最低dNTP濃度。例如在100μl的反應(yīng)體系中，4種dNTP的濃度為20 μmol/L，可基本滿足合成2.6μgDNA或10pmol/L的400bp序列。使用低dNTP濃度(每種dNTP濃度為2μmol/L)，能夠高度靈敏地(1/107)擴(kuò)增ras基因點(diǎn)突變的等位基因。
有時(shí)，使用高濃度dNTP也可能也是有益的，特別是在存在高濃度 Mg2+的情況下，因?yàn)镸g2+可與dNTP結(jié)合，減少可被引入的dNTP量。但同時(shí)，當(dāng)dNTP超過最佳濃度時(shí)，會(huì)抑制PCR反應(yīng)。為使DNA聚合酶完成有效擴(kuò)增，反應(yīng)中的游離dNTP濃度不得超過 0.010–0.015mM（其估計(jì)Km值）。當(dāng)使用非校正DNA聚合酶時(shí)，可通過降低dNTP濃度（0.01–0.05 mM）和成比例減少 Mg2+來提高保真度。
3.Taq DNA聚合酶：DNA聚合酶是PCR的重要組成部分，它們能夠從單鏈DNA模板合成新的互補(bǔ)鏈。所有DNA聚合酶都具有 5′→ 3′ 聚合酶活性，即摻入核苷酸并使引物從按5'至3’方向延伸。
早期的PCR，通常使用來源于大腸桿菌的DNA聚合酶I上的 Klenow片段來生成新的子鏈。但是，這種大腸桿菌酶對(duì)熱敏感，易受到變性階段高溫度的破壞，從而無法繼續(xù)進(jìn)行退火和延伸步驟。因此，需要在全程每個(gè)循環(huán)的退火步驟中重新補(bǔ)充酶。
熱穩(wěn)定DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)是一項(xiàng)重大進(jìn)步。它實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)穩(wěn)定性，為PCR方法的改進(jìn)提供了無限可能。1976年，從耐熱菌Thermus aquaticus中分離出來的Taq DNA 聚合酶是最有名的熱穩(wěn)定DNA聚合酶之一。1988年研究人員首次報(bào)道，證明TaqDNA聚合酶能夠在 75℃以上保持活性，從而無需手動(dòng)加入新鮮的酶即可持續(xù)循環(huán)擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了工作流程自動(dòng)化。此外，與大腸桿菌 DNA聚合酶相比，Taq DNA 聚合酶能夠獲得更長(zhǎng)的PCR擴(kuò)增子，并且具有更高的靈敏度、特異性和得率。也因此，Taq DNA 聚合酶被《科學(xué)》雜志評(píng)為1989年的“年度分子”。
盡管 Taq DNA聚合酶大大改善了PCR實(shí)驗(yàn)方法，但也表現(xiàn)出一些缺點(diǎn)。例如，Taq DNA 聚合酶在90℃以上的DNA鏈變性溫度中相對(duì)不穩(wěn)定。對(duì)于需要更高解離溫度的富含GC和/或具有強(qiáng)二級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA模板而言，這一問題尤為明顯。同時(shí)，Taq DNA 酶還缺乏校正活性，會(huì)在擴(kuò)增期間引入錯(cuò)誤核苷酸。對(duì)于克隆和測(cè)序而言，序列的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，所以不能存在含有錯(cuò)配的PCR擴(kuò)增子。此外，Taq DNA 聚合酶的易錯(cuò)配特性使其通常無法穩(wěn)定擴(kuò)增長(zhǎng)度大于5kb的片段。為克服這些缺點(diǎn)，性能更好的DNA聚合酶不斷被開發(fā)出來，使PCR在廣泛的生物學(xué)應(yīng)用中發(fā)揮其強(qiáng)大的功能。
目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化--典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U（指總反應(yīng)體積為100 ul時(shí)），濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。
4.引物：PCR引物是含有15-30個(gè)堿基的合成DNA寡核苷酸。能夠與模板DNA中目標(biāo)區(qū)域的側(cè)翼序列結(jié)合（通過序列互補(bǔ)）。在PCR反應(yīng)期間，DNA聚合酶從 3′端開始延伸引物。因此，引物結(jié)合位點(diǎn)必須是靶標(biāo)附近所特有的，并且與起始DNA的其它部分序列具有最小的同源性，以確保目的片段的特異性擴(kuò)增。
除了序列同源性，引物還必須考慮到其它相關(guān)問題，，以確保PCR擴(kuò)增的特異性。首先，引物序列的熔解溫度（Tm）必須在 55–70℃之間，兩種引物的 Tm相差不超過 5℃。同樣重要的是，引物的序列不能具有互補(bǔ)性（特別是3’末端），若兩個(gè)引物互補(bǔ)會(huì)促進(jìn)退火（即，引物二聚體），自我互補(bǔ)會(huì)導(dǎo)致自我配對(duì)（即，二級(jí)結(jié)構(gòu)），或序列的直接重復(fù)會(huì)導(dǎo)致與模板目標(biāo)區(qū)域產(chǎn)生不完全配對(duì)。引物的GC含量最好在40-60%之間，均勻的C和G分布能夠避免錯(cuò)誤發(fā)生。同樣，為了盡量減少非特異性，引物3′端最多只能含有3個(gè)G或C堿基。另一方面，引物3′端含有1個(gè)C或G核苷酸有利于引物的錨定和延伸。
引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板 DNA在體外大量擴(kuò)增。
長(zhǎng)序列引物（如，>50 nt）或堿基經(jīng)修飾的引物通常需要進(jìn)行純化，以去除非全長(zhǎng)產(chǎn)物和未結(jié)合的核苷酸。對(duì)于分子克隆和突變等應(yīng)用，建議將引物進(jìn)行純化，序列和長(zhǎng)度的完整性對(duì)于實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。
為PCR克隆設(shè)計(jì)引物時(shí)，可在5'末端引入限制性酶切位點(diǎn)、重組序列和啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)等延伸的非模板序列。這些延伸序列需進(jìn)行精心設(shè)計(jì)，以盡量減小對(duì)PCR擴(kuò)增和下游實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的影響。
在配制PCR反應(yīng)體系時(shí)，引物加入量應(yīng)在0.1–1μM范圍內(nèi)。對(duì)于含有簡(jiǎn)并堿基或用于長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增的引物，常用的引物濃度為0.3–1μM 。通常，建議先使用標(biāo)準(zhǔn)濃度，然后根據(jù)需要再進(jìn)行調(diào)整。引物濃度過高容易產(chǎn)生錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增。而引物濃度過低可能會(huì)導(dǎo)致目的片段的少量擴(kuò)增或無擴(kuò)增。
5.鎂離子（Mg2+）：鎂離子（Mg2+）作為DNA聚合酶活性的輔助因子，有助于聚合期間dNTP的結(jié)合。酶活性位點(diǎn)處的鎂離子可催化引物的3′-OH與dNTP的磷酸基團(tuán)間形成磷酸二酯鍵。此外，Mg2+ 能夠穩(wěn)定磷酸鹽骨架上的負(fù)電荷，從而促進(jìn)引物與DNA模板形成復(fù)合物。
通常情況下，Mg2+ 以MgCl2 的形式提供。但是，因硫酸鹽在某些情況下有助于確保更穩(wěn)定和可重現(xiàn)的性能，諸如 Pfu DNA聚合酶等一些聚合酶首選MgSO4。由于鎂離子能夠與dNTP、引物、DNA模板和EDTA（如果存在）結(jié)合，因此，通常需要對(duì)鎂離子濃度進(jìn)行優(yōu)化，以盡量提高PCR得率，并保持其擴(kuò)增特異性。
在PCR中，標(biāo)準(zhǔn)的 Mg2+ 終濃度范圍為1–4mM，建議優(yōu)化滴定增量為0.5mM。Mg2+ 濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶活性，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物較少或無PCR產(chǎn)物。另一方面，Mg2+ 濃度過高則會(huì)提高引物-模板復(fù)合物的穩(wěn)定性，反應(yīng)特異性降低，產(chǎn)生非特異性PCR產(chǎn)物，并增加由dNTP錯(cuò)誤插入導(dǎo)致的復(fù)制錯(cuò)誤。
6.緩沖液：用于維持DNA聚合酶的活性和穩(wěn)定性。緩沖液pH通常為8.0-9.5，一般使用Tris-HCl來調(diào)節(jié)。
對(duì)于 Taq DNA 聚合酶，緩沖液的一個(gè)常見成分是來自KCl的鉀離子（K+)，其可促進(jìn)引物的吸附。有時(shí)，也可使用硫酸銨(NH4)2SO4 代替KCl。銨離子(NH4+) 具有去穩(wěn)定作用，尤其對(duì)于錯(cuò)配引物-模板復(fù)合物堿基對(duì)之間的弱氫鍵，因此可增強(qiáng)反應(yīng)特異性。
由于 Mg2+ 與K+具有相似的穩(wěn)定效應(yīng)，因此，當(dāng)使用KCl緩沖液時(shí)，MgCl2 的建議濃度通常較低(1.5 ± 0.25 mM) ，當(dāng)使用(NH4)2SO4 緩沖液時(shí)，MgCl2的建議濃度通常較高 (2.0 ± 0.5 mM)。由于NH4+ 與Mg2+具有拮抗效應(yīng)，因此，在各種 Mg2+ 濃度下，含有(NH4)2SO4 的緩沖液都表現(xiàn)出更高的引物特異性。由于最佳的PCR緩沖液取決于所使用的DNA聚合酶類型，所以有必要遵循酶供應(yīng)商的提供的緩沖液建議。
在某些情況下，可在緩沖液中加入化學(xué)添加劑或輔助溶劑，通過減少錯(cuò)配來提高擴(kuò)增特異性，并通過去除二級(jí)結(jié)構(gòu)來提高擴(kuò)增效率。此外，一些DNA聚合酶還隨附提供了專為DNA聚合酶和PCR緩沖液優(yōu)化的特殊增強(qiáng)劑。這些試劑常用于困難樣品，如富含GC的模板。應(yīng)注意，使用化學(xué)添加劑或輔助溶劑會(huì)影響引物退火、模板變性、 Mg2+ 結(jié)合以及酶活性。同時(shí)，它們還會(huì)干擾某些下游應(yīng)用——例如，基因芯片實(shí)驗(yàn)中的非離子去污劑。因此，為了成功進(jìn)行PCR擴(kuò)增和下游實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，應(yīng)慎重考慮緩沖液組成成分。
7.熱循環(huán)儀:熱循環(huán)儀是一種能夠?yàn)镻CR反應(yīng)自動(dòng)完成溫度循環(huán)和孵育的儀器。在引入熱循環(huán)儀之前，PCR反應(yīng)是一個(gè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的過程，需在不同溫度的水浴之間轉(zhuǎn)移樣品，并為每個(gè)步驟需要精確定時(shí)。熱循環(huán)儀和 Taq DNA 聚合酶的發(fā)現(xiàn)，讓PCR的自動(dòng)化成為現(xiàn)實(shí)。第一款自動(dòng)化PCR熱循環(huán)儀是在1985年由PerkinElmer和Cetus以合資方式引入市場(chǎng)的。二、PCR反應(yīng)條件
1.變性溫度與時(shí)間模板變性溫度是決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA解鏈的溫度，達(dá)不到變性溫度就不會(huì)產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR也就不會(huì)啟動(dòng)。變性溫度低則變性不完全，DNA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量。變性溫度太高，又會(huì)影響酶的活性，一般情況下可設(shè)為94℃ 20-30秒，高溫時(shí)間應(yīng)盡量縮短，以保持耐熱DNA聚合酶的活力，最高變性溫度不宜超過95℃。
2.退火溫度與實(shí)踐退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量。溫度高特異性強(qiáng)，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴(kuò)增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板錯(cuò)配，非特異性產(chǎn)物增加。合適的退火溫度一般在45-68℃之間。設(shè)置特定反應(yīng)的最適退火溫度，可根據(jù)引物的（G+C）%含量進(jìn)行推測(cè)，一般實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度Tm低5℃，退火時(shí)間一般為30-60秒，足以使引物與模板之間結(jié)合，沒有必要長(zhǎng)時(shí)間退火。
3.延伸溫度與時(shí)間PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70-75℃之間，延伸時(shí)間根據(jù)所有聚合酶擴(kuò)增速度和擴(kuò)增片段大小設(shè)定。如同樣擴(kuò)增2kb片段，若使用Taq酶只需要1分鐘，使用Pfu酶則應(yīng)設(shè)定2分鐘以上。延伸時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。時(shí)間太短則可能得不到擴(kuò)增產(chǎn)物或得到一些短的非特異性片段。
4.循環(huán)次數(shù)可根據(jù)模板DNA的量，擴(kuò)增片段的大小和擴(kuò)增產(chǎn)物的下步應(yīng)用等因素，設(shè)定30-40個(gè)循環(huán)。循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足，如果循環(huán)次數(shù)太多，錯(cuò)配幾率會(huì)增加，非特異性背景嚴(yán)重。所以，在保證產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。

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