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科研顧問_Gu新蟲 (小有名氣)
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干貨分享 | 一文了解分子生物實驗常用的幾種酶的作用原理
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01 限制性內(nèi)切核酸酶 圖片 限制酶主要存在于微生物(細菌、霉菌等)中。 一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點上切割DNA分子。是特異性地切斷DNA鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶(“分子手術刀”)。 發(fā)現(xiàn)于原核生物體內(nèi)，現(xiàn)已分離出100多種，幾乎所有的原核生物都含有這種酶。是重組DNA技術和基因診斷中重要的一類工具酶。例如，從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的一種限制酶只能識別GAATTC序列，并在G和A之間將這段序列切開。 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了200多種限制酶，它們的切點各不相同。蘇云金芽孢桿菌中的抗蟲基因，就能被某種限制酶切割下來。 02 DNA連接酶 圖片 DNA酶能利用ATP或NAD+水解提供的能量催化DNA鏈的5'-磷酸末端與另一DNA鏈的3'-OH生成3',5'-磷酸二酯鍵，從而把兩個DNA鏈連接起來。 常見的DNA連接酶有T4 DNA連接酶，Taq DNA連接酶等，這些酶的主要連接DNA片段之間的磷酸二酯鍵，起連接作用。 03 DNA聚合酶 圖片 DNA聚合酶的主要功能是催化脫氧核苷酸之間的聚合反應。主要是連接DNA片段與單個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵，在DNA復制中起作用。 DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在單個核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。 DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補的DNA鏈;而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來。因此DNA連接酶不需要模板。 04 RNA聚合酶 圖片 RNA聚合酶以完整的雙鏈DNA為模板，轉(zhuǎn)錄時DNA的雙鏈結構部分解開，轉(zhuǎn)錄后DNA仍然保持雙鏈的結構。 真核生物RNA聚合酶：真核生物的轉(zhuǎn)錄機制要復雜得多，有三種細胞核內(nèi)的RNA聚合酶：RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄rRNA，RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄mRNA，RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄tRNA和其它小分子RNA。在RNA復制和轉(zhuǎn)錄中起作用。 05 逆轉(zhuǎn)錄酶 圖片 逆轉(zhuǎn)錄酶是屬RNA指導的DNA聚合酶，具有三種酶活性，即RNA指導的DNA聚合酶，RNA酶，DNA指導的DNA聚合酶。 在分子生物學技術中，作為重要的工具酶被廣泛用于建立基因文庫、獲得目的基因等工作。 06 解旋酶 圖片 解旋酶是一類解開氫鍵的酶，由水解ATP來供給能量它們常常依賴于單鏈的存在，并能識別復制叉的單鏈結構。在細菌中類似的解旋酶很多，都具有ATP酶的活性。大部分的移動方向是5'→3'，但也有3'→5'移動的情況，如n'蛋白在φχ174以正鏈為模板合成復制形的過程中，就是按3'→5'移動。在DNA復制中起作用。 07 核酸酶 圖片 核酸酶就是指能降解核酸的酶，與聚合酶的功能相反，它們水解或打開在多核苷酸鏈中的相鄰核苷酸的磷酸二酯鍵內(nèi)的酯鍵。根據(jù)其特性不同，將核酸酶分為內(nèi)切核酸酶和外切核酸酶，內(nèi)切核酸酶能水解多核苷酸鏈中的內(nèi)部鍵，而外切核酸酶則必須從末端開始水解反應。 根據(jù)其對核酸專一性，分為對DNA產(chǎn)生專一性作用的DNA酶（DNase);或?qū)NA特異性作用的RNA酶（RNase);甚至對DNA/RNA雜合體特異性作用的RNA酶H（RNase H),它切割雜合雙連體的RNA鏈。 08 蛋白酶K 圖片 蛋白酶K是一種從白色念珠菌分離出來的強力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，在較廣的pH范圍（4〜12.5)內(nèi)及高溫 (50〜70°C)下均有活性，EDTA等螯合劑或SDS等去垢劑均不能使之失活。用于質(zhì)�；蚧蚪MDNA、RNA的分離和抽提。 在病毒核酸檢測中，蛋白酶K是病毒采樣液中的重要組分之一，蛋白酶K可以裂解病毒的外殼蛋白并使其失活，同時將病毒基因組釋放以便后續(xù)進行核酸抽提。 09 UNG酶 圖片 UNG酶（Uracil-N-Glycosylase）的作用原理是選擇性水解斷裂含有dUTP的雙鏈或單鏈DNA中的尿嘧啶糖苷鍵，形成的有缺失堿基的DNA鏈，在堿性介質(zhì)以及高溫下會進一步水解斷裂，從而被消除；UNG酶的最佳活性溫度為50℃，在95℃會被滅活。 由于普通的Taq酶即使在室溫下也有一定的活性，如果不采取措施，在加入PCR試劑的過程中、正式PCR開始前就會發(fā)生少量擴增，從而增加背景信號，可能影響PCR定量的精度。 因此在PCR試劑盒中可使用dUTP代替dTTP，如果在實驗前產(chǎn)生非特異性擴增，產(chǎn)物會含有dUTP，在定量PCR開始前增加50℃的保溫步驟，UNG酶即可將已有的PCR產(chǎn)物降解破壞，防止可能造成的污染。 |
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