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生信專區(qū)｜全基因組DNA甲基化測序數(shù)據(jù)工作流程分析和性能評估、分析軟件比較
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 DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因組印記、干細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育和炎癥等過程有關(guān)。DNA甲基化異�？赡芙沂炯膊顟B(tài)，包括癌癥和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。因此，人類基因組中5-甲基胞嘧啶（5mC）分布和位點(diǎn)是一個重要的研究方向。全基因組重亞硫酸鹽測序(Whole-genome bisulfite sequencing, WGBS)是一種用于分析DNA甲基化的高通量方法，本文綜述了WGBS的關(guān)鍵步驟，總結(jié)了可用且最新的分析工具，比較了比對算法，并分享了數(shù)據(jù)處理的示例代碼，為科研人員的DNA甲基化研究提供參考。標(biāo)題：Analysis and Performance Assessment of the Whole Genome Bisulfite Sequencing Data Workflow: Currently Available Tools and a Practical Guide to Advance DNA Methylation Studies 期刊：《small methods》 時間：2022年3月 影響因子：10.7 WGBS文庫制備 廣泛使用的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化文庫構(gòu)建方法：Accel-NGS Methyl-Seq（Accel）、TruSeq DNA Methylation（TruSeq）和SPlinted ligation adapter tagging（SPLAT）。 WGBS分析流程 在處理原始測序數(shù)據(jù)時，生物信息學(xué)分析流程的可重復(fù)性和一致性至關(guān)重要。由于WGBS數(shù)據(jù)通常很龐大，因此需要大量的計(jì)算資源、內(nèi)存和存儲空間。這就要求分析流程不僅要穩(wěn)定，還要高效地使用內(nèi)存和時間。 （1）質(zhì)量評估（Quality Assessment） 預(yù)比對質(zhì)量評估確保了原始數(shù)據(jù)的正確輸入并提高了可比對性。多維度評估審查了低質(zhì)量reads、接頭序列、污染序列和重復(fù)reads。合成測序（增加測序的堿基數(shù)量）會降低質(zhì)量，尤其是Illumina平臺。在測序過程中，DNA簇中的單個分子可能無法成功合成。錯誤合成的分子聚類會導(dǎo)致motif calling錯誤，這些錯誤與片段長強(qiáng)正相關(guān)。文庫構(gòu)建中長片段比例越高，可能會導(dǎo)致更多的calling錯誤、較低的Phred得分和更高的不匹配率，特別是對于成對末端對齊。建議保留質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥30的堿基，這表示對motif calling準(zhǔn)確性99.9%。DNA測序反應(yīng)讀長通常比DNA片段長，片段兩端的接頭序列可能被錯誤地測序，這會引入構(gòu)成性的甲基化C，并在隨后的甲基化calling中引起偏差，因此建議提前檢查并修剪接頭。數(shù)據(jù)可能被污染，包括在文庫制備步驟中添加引物和載體序列，以及為校準(zhǔn)測序反應(yīng)中的序列質(zhì)量而添加的Phi X噬菌體DNA。過度表示的污染物通常呈現(xiàn)顯著高于核基因組的reads深度，導(dǎo)致在比對過程中失敗。當(dāng)同一DNA片段被雙重計(jì)數(shù)時，可能會發(fā)生重復(fù)reads（兩個具有相同基因位點(diǎn)的reads）。 長插入片段可能會從更高比例的高質(zhì)量reads、較少接頭污染和更高有效reads深度（增加基因組覆蓋效率）中受益。TruSeq文庫制備需要特別注意重復(fù)reads，其PCR擴(kuò)增cycles數(shù)量大約是Accel的兩倍（10-12 cycles對比6-9 cycles）。 建議使用FastQC對原始FASTQ文件在修剪前后進(jìn)行質(zhì)量評估。QC結(jié)果包括一個.HTML格式的摘要和包含質(zhì)量圖表的.zip文件夾。檢測每個樣本的總reads數(shù)、每個堿基的序列質(zhì)量和接頭檢測圖，以確保良好的質(zhì)量比對和比對reads數(shù)量。在亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化過程中觀察到GC比率和內(nèi)容分布的偏倚，修剪后的FastQC報告作為雙重保障，確保在修剪后（去除接頭）每個樣本的總reads數(shù)保持不變，并確保隨機(jī)引物引起的堿基序列變化。 （2）reads修剪（Trimming） 使用FastQC對原始FASTQ文件進(jìn)行質(zhì)量評估后，可以利用Trim Galore軟件（具有簡化的命令行和參數(shù)，能夠自動識別技術(shù)序列）和Trimmomatic軟件對低質(zhì)量reads、接頭序列、污染序列、重復(fù)序列進(jìn)行去除。這一步驟稱之為修剪(Trimming)。WGBS數(shù)據(jù)修剪主要有兩個方面：質(zhì)量修剪和接頭去除。質(zhì)量修剪側(cè)重于原始reads端的質(zhì)量下降，以及序列組成的頭部和尾部偏差。修剪方法包括剪除低于特定質(zhì)量閾值的區(qū)域（Phred默認(rèn)分?jǐn)?shù)為20，表示1/100的堿基可能是錯誤的），或者從reads開始和結(jié)束修剪自定數(shù)量堿基。對于非亞硫酸鹽測序的接頭去除，依賴于“過度表示的序列”和“每條序列的GC含量”。由于CG含量在WGBS數(shù)據(jù)中不適用，過度表示的序列作為接頭污染的指標(biāo)，在Trim Galore中通常被檢測到。修剪參數(shù)的其他考慮因素是文庫方向和輸入reads的成對/單端特性。Trim Galore對文庫的默認(rèn)設(shè)置具有方向性，在Trim Galore中應(yīng)指定成對末端的特性，以保持成對reads，以便進(jìn)一步比對。兩個文件的reads數(shù)不匹配和reads名稱不一致會觸發(fā)警告。 （3）比對（Alignment） WGBS的原理是對未甲基化的胞嘧啶(Cs)通過亞硫酸鹽處理轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶(Ts)，同時保留甲基化的Cs。理想情況下，當(dāng)reads序列比對到參考基因組時，可以識別未甲基化的Cs。然而亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化帶來數(shù)據(jù)比對兩大計(jì)算挑戰(zhàn)：C-T比對不匹配和序列復(fù)雜性降低。C-T比對不匹配指的是在測序reads中，T可能與參考基因組中的C比對，反之則不然。序列復(fù)雜性降低使得難以區(qū)分轉(zhuǎn)化后的Ts與系統(tǒng)錯誤，夸大了比對不準(zhǔn)確。 為了解決這種變化帶來的reads與參考基因組不匹配的問題，有兩種主要的比對策略：三字符策略和通配符策略。三字符策略通過將參考基因組和序列reads中的所有Cs轉(zhuǎn)換為Ts，將基于四字符的基因組簡化為基于三字符的基因組。之后使用標(biāo)準(zhǔn)的比對工具處理reads序列，如Bowtie1或Bowtie2、BWA mem和GEM3，主要采用Burrows-Wheeler變換(BWT)回溯算法。而通配符策略用基因組中的Cs轉(zhuǎn)換為Ys，這可以與reads序列中的Cs和Ts進(jìn)行匹配。在選擇比對工具時，比對的準(zhǔn)確性和計(jì)算時間是主要的考慮因素。Bock(2012)建議，通配符比對策略實(shí)現(xiàn)了更高的基因組覆蓋率，但增加了高甲基化水平評估偏差的可能，而三字符策略則相反。通配符比對軟件在BS轉(zhuǎn)化reads中保留Cs，并將序列復(fù)雜性提高到確保與參考基因組唯一比對水平，而三字符比對軟件在BS轉(zhuǎn)化reads中去除Cs，降低序列復(fù)雜性，增加了模糊比對位點(diǎn)的機(jī)會。但覆蓋差異和M偏差僅在基因組中的高相似區(qū)域中表現(xiàn)出來，因此在如人類基因組的長序列reads比對不太相關(guān)。因此在比對軟件選擇中優(yōu)先考慮計(jì)算速度和內(nèi)存消耗。研究表明如Bismark和BWA-METH等三字符比對軟件在運(yùn)行時間和峰值內(nèi)存使用方面優(yōu)于如BRAT_BW、BSMAP和GSnap的通配符比對軟件。 在眾多比對軟件中，BitMapperBS和FMtree相對更節(jié)省時間，但與Bismark、BWA-METH和gemBS比對軟件相比，在1,000,000 bp成對末端模擬數(shù)據(jù)read上，并沒有觀察到6-7倍的計(jì)算時間減少。對于處理大型哺乳動物測序項(xiàng)目的人來說，從大約24小時減少到7-8小時可能是有說服力的，盡管在追求速度時可能會犧牲比對質(zhì)量。BitMapperBS可能無法保證在有多個不匹配的情況下獲得最高質(zhì)量比對，因此作者更為推薦Bismark、BWA-METH、gemBS，這幾款軟件能節(jié)省約1/3的運(yùn)行時間且能良好的平衡運(yùn)行時間與比對質(zhì)量之間的關(guān)系。 用于亞硫酸鹽處理reads比對算法在運(yùn)行時間和比對質(zhì)量上的差異會影響下游的甲基化calling。在Accel-NGS MethylSeq、SPLAT和TruSeq等WGBS框架以及TrueMethyl和EMSeq的氧化亞硫酸鹽測序中，對廣泛應(yīng)用的比對軟件Bismark、BitMapperBS、BWA-METH和gemBS進(jìn)行評估。通過使用Seqtk的相同數(shù)據(jù)檢測的五種文庫制備方法，從樣本數(shù)據(jù)中減去1,000,000 bp成對末端reads，比較其運(yùn)行速度。比較結(jié)果顯示，BitMapperBS具有最高的對齊速度，平均每秒約550-650 reads（表1）。Bismark、BWA-METH和gemBS顯示出相同的比對速度（約每秒200-300reads0；而Bismark最不穩(wěn)定。 四個比對工具在甲基化calling后的比對質(zhì)量顯示，BWA-METH和gemBS有最高的唯一比對率和最少的未比對reads（圖3A）。在每個染色體的平均CpG覆蓋度≤×10時存在微小差異，在≥×20覆蓋度時，BWA-METH比其他方法有略好的覆蓋度（圖3B）。DNA片段兩端未甲基化的Cs數(shù)量對于從比對結(jié)果中獲得合格的DNA甲基化calling至關(guān)重要。使用M-bias圖對每個流程比對結(jié)果的影響規(guī)模非常相似，盡管在不同文庫之間存在較大差異（圖3C）。使用比對軟件在基因組上calling的CpGs一致性顯示，在每個注釋區(qū)域和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSSs)周圍的平均甲基化水平上顯示出可比的基因組富集分布（圖3D-E）。與此同時，甲基化extraction水平不受比對軟件選擇的影響，因?yàn)锽ismark與其他三種比對軟件相比，甲基化calling相關(guān)性只略降低（圖4）。 （4）比對質(zhì)量評估（Alignment quality control） 比對后的QC在WGBS中至關(guān)重要，WGBS的內(nèi)在混雜變量會使甲基化估計(jì)偏向于過高或過低的估計(jì)，主要通過M-bias圖來檢測。在亞硫酸鹽處理過程中可能會發(fā)生部分（不完全）甲基化，此時可以觀察到C和T的peaks值，這通常會導(dǎo)致檢測過高。高于98.5%的比率可以確保沒有偏差。可以在所有背景中（CpG、CHG和CHH）向甲基化樣本中添加帶有未甲基化C的Spike序列，然后計(jì)數(shù)未甲基化C和T數(shù)量，并計(jì)算添加序列的轉(zhuǎn)化率。 同時，由于估計(jì)過低導(dǎo)致的偏差會捕獲到假陰性的甲基化位點(diǎn)。例如，通過酶介導(dǎo)的碎片化雙鏈DNA末端修復(fù)會在片段兩端引入未甲基化的C，從而導(dǎo)致人為的甲基化水平低估。這在M-bias圖中反映為問題兩端的平均甲基化水平急劇下降，這應(yīng)在提取甲基化之前予以丟棄。亞硫酸鹽介導(dǎo)的降解是WGBS中偏差的主要來源，因?yàn)榻到夥请S機(jī)，發(fā)生在未甲基化的胞嘧啶上，這些胞嘧啶從文庫中舍棄。這導(dǎo)致許多隨后的序列偏差和整體甲基化的高估。 （5）甲基化信息提取（Methylation extraction） 在經(jīng)過BitMapperBS、BWA-METH、Bismark和GemBS等比對軟件進(jìn)行比對后，推薦利用MethylDackel進(jìn)行甲基化信息提取。例如用MethylDackel對BitMapperBS比對后的甲基化信息提取。甲基化評估通過比較測序reads和參考基因組進(jìn)行，如果在參考基因組中某個位點(diǎn)顯示為C，在上述位點(diǎn)注意到C時，就分配100%的甲基化，當(dāng)指示為T時，則分配0%的甲基化。計(jì)算加權(quán)平均值，并在計(jì)算該位點(diǎn)的C和T數(shù)量后，將其指定為最終的甲基化水平。如10/10 Cs顯示完全胞嘧啶甲基化，6/10 Cs顯示部分甲基化（60%），0/10 Cs代表未甲基化胞嘧啶。在提取之前，對兩個鏈中每個位點(diǎn)的平均甲基化水平進(jìn)行M-bias分析，以識別提取reads時的基本技術(shù)偏差作為修剪參考。從理論上講，reads應(yīng)該是恒定的，但每對中的第一和第二reads通常在5'和3'端有偏倚。reads中的人為噪聲會在提取過程中引發(fā)錯誤的甲基化calling。MethylDackel在頂部和底部線條上給出了修剪建議，這些建議可以作為后續(xù)提取的參數(shù)。MethylDackel通過比對得到的BAM文件生成bedGraph文件，記錄甲基化與未甲基化位點(diǎn)信息，這些可以用來進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾和進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析。 數(shù)據(jù)歸一化與統(tǒng)計(jì)分析 （1）CpG甲基化 文庫制備方法會顯著影響每個CpG位點(diǎn)的平均覆蓋度。與甲基化芯片數(shù)據(jù)不同，測序數(shù)據(jù)沒有標(biāo)準(zhǔn)化的歸一化方法。但數(shù)據(jù)歸一化對下游差異甲基化檢測至關(guān)重要。降采樣(Downsampling)通過減少reads序列數(shù)量，使其與相似序列數(shù)據(jù)相匹配，從而實(shí)現(xiàn)歸一化。比對產(chǎn)生的BAM文件和甲基化提取產(chǎn)生的bedGraph文件都可以降采樣。在比對階段降采樣可能在時間和內(nèi)存上要求很高，而在提取階段降采樣則需要較少的時間和內(nèi)存，同時保證了相似的甲基化calling數(shù)量、檢測到的CpG位點(diǎn)、reads數(shù)分布和平均覆蓋度的準(zhǔn)確性。因此，在進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)比較之前，建議先對bedGraph文件進(jìn)行降采樣，特別是對于差異甲基化區(qū)域（DMRs）的檢測。 （2）DMR DMR（差異甲基化區(qū)域）檢測是核心甲基化分析之一，涉及對多個樣本中的基因組區(qū)域進(jìn)行分析。最常見的應(yīng)用是在癌癥和正常樣本之間尋找可能作為生物標(biāo)志物或揭示疾病生物學(xué)的異常甲基化區(qū)域�；贒MR統(tǒng)計(jì)分析方法因軟件而異，以下是一些主要方法。 BSmooth：使用局部似然平滑方法（local likelihood smoothing approach）來鑒定樣本特異性甲基化信息中的DMR。應(yīng)用Welch's t-test（Student's t-test變體）比較多個樣本。DMR是具有觀察到的P值高于預(yù)定義β值的CpG位點(diǎn)。然而預(yù)定義閾值可能導(dǎo)致II類錯誤（假陰性），從而影響結(jié)果。 BiSeq：通過納入錯誤發(fā)現(xiàn)率和β二項(xiàng)分布模型來解決這一問題，充分考慮到生物學(xué)重復(fù)。然后通過triangular kernel模型調(diào)整分層過程引起的顯著變化，計(jì)算目標(biāo)區(qū)域的統(tǒng)計(jì)顯著性。P值被歸一化、轉(zhuǎn)換為z分?jǐn)?shù)、平均值進(jìn)行比較。 MethylSig：類似于BiSeq，應(yīng)用β二項(xiàng)分布模型來考慮reads覆蓋度和生物學(xué)意義。 Metilene：結(jié)合了二項(xiàng)分割和多變量Kolmogorov-Smirnov擬合優(yōu)度檢驗(yàn)(K-S 檢驗(yàn))。這種非參數(shù)方法使用逐步分割基因組區(qū)域，被穩(wěn)步地最小化到CpG數(shù)量少于預(yù)定義下限的區(qū)域，或在統(tǒng)計(jì)顯著性上沒有改善的區(qū)域。這種方法對累積樣本分布的差異性更敏感。 methylKit：對單樣本情況使用Fisher's精確檢驗(yàn)，對多重復(fù)樣本使用基于logistical回歸的統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算組間差異。 Defiant：是一個獨(dú)立的程序，使用加權(quán)Welch擴(kuò)展鑒定DMR。對于只有一個重復(fù)的兩個樣本，使用Fisher's精確檢驗(yàn)，對于有多個重復(fù)的樣本，使用Welch's t-test，基于覆蓋度對無偏樣本方差進(jìn)行加權(quán)。 Benjamini-Hochberg：應(yīng)用于調(diào)整DMR鑒定中多重t檢驗(yàn)的P值。數(shù)據(jù)分布本質(zhì)上是二項(xiàng)的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)甲基化分布要么是完全甲基化的，要么是完全未甲基化的，表明二項(xiàng)分布模型性能優(yōu)于其他模型。 由于reads覆蓋度變化和人口統(tǒng)計(jì)參數(shù)（如性別、年齡和種族）的共變異對DMR檢測有強(qiáng)相關(guān)，因此數(shù)據(jù)的歸一化轉(zhuǎn)換和協(xié)變量調(diào)整至關(guān)重要。 案例研究 WGBS 數(shù)據(jù)的計(jì)算分析具有挑戰(zhàn)性，包括分析 FASTQ 讀長、甲基化估計(jì)、位點(diǎn)注釋、DMR 檢測和可視化。以下為WGBS數(shù)據(jù)分析的綜合案例研究。 （1）分析工具 （2）數(shù)據(jù)分析 ① Pre-alignment 結(jié)果包括一個.html格式的摘要和一個帶有質(zhì)量數(shù)字的.zip文件夾。MultiQC 將具有多個 FastQC 結(jié)果的樣品合并到一份.html報告中。 ② reads修剪 ③ 比對和甲基化calling Bismark： BitMapperBS: DMR的注釋和分析 易小結(jié)： DNA甲基化和其他表觀基因組分析的動態(tài)標(biāo)記與不同人類疾病的診斷和預(yù)后相關(guān)聯(lián)。對甲基化結(jié)果的深刻且低偏倚解釋是下游生物學(xué)機(jī)制研究的核心。本綜述討論了分析WGBS數(shù)據(jù)的計(jì)算方法，并介紹了使用現(xiàn)有工具從原始reads檢測DMR所需的基本QC分析步驟。此外，還提出了甲基化文庫制備和數(shù)據(jù)處理中固有的潛在混雜因素及其對策。希望潛在用戶能夠理解WGBS的基本概念，從而加速人類疾病的發(fā)現(xiàn)。 參考文獻(xiàn)： 1、Gong T, Borgard H, Zhang Z, Chen S, Gao Z, Deng Y. Analysis and Performance Assessment of the Whole Genome Bisulfite Sequencing Data Workflow: Currently Available Tools and a Practical Guide to Advance DNA Methylation Studies. Small Methods. 2022 Mar;6(3):e2101251. doi: 10.1002/smtd.202101251. PubMed PMID: 35064762. 以后會經(jīng)常更新生物信息干貨內(nèi)容，歡迎一起交流～  |
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