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[交流] 國自然熱點(diǎn) | Cell再發(fā)刊！蘇州大學(xué)揭示乳酸化調(diào)控腫瘤真相

乳酸化修飾一直以來都是國自然熱點(diǎn)，高分文章頻出。此前乳酸化修飾多聚焦于組蛋白研究中，也有部分非組蛋白的研究，例如浙江大學(xué)發(fā)表于Molecular Cell的文字表明乳酸也可直接修飾METTL3蛋白提升其酶活性。但是這些大多是乳酸化修飾對(duì)腫瘤正相關(guān)蛋白的研究而對(duì)于腫瘤抑制因子的研究較少。

近期，蘇州大學(xué)周芳芳在Cell發(fā)表了題為Alanyl-tRNA synthetase, AARS1, is a lactate sensor and lactyltransferase that lactylates p53 and contributes to tumorigenesis（IF=45.5）的文章發(fā)現(xiàn)腫瘤來源的乳酸是p53的天然抑制劑，并篩選出AARS 1作為細(xì)胞內(nèi)L-乳酸傳感器和乳酰轉(zhuǎn)移酶，介導(dǎo)整體賴氨酸乳�；邢騪53。p53在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中特定賴氨酸殘基處的乳�；瘯�(huì)減弱其DNA結(jié)合和液液相分離（LIPS），從而降低p53的腫瘤抑制作用。

1 文章亮點(diǎn)
腫瘤來源的乳酸能夠腫瘤抑制因子p53的功能，但不影響其基因和蛋白的表達(dá)。

AARS1是細(xì)胞內(nèi)乳酸傳感器，介導(dǎo)全局賴氨酸乳酸化。

p53在K120和K139殘基上的AARS1乳酸化損害了p53的LLPS和DNA結(jié)合。

β-丙氨酸抑制乳酸結(jié)合AARS1，整體乳酸化和腫瘤發(fā)生。
2 思路解析
本文最大的亮點(diǎn)就在于作者發(fā)現(xiàn)了乳酸化修飾能夠抑制抑癌蛋白p53與DNA的結(jié)合，進(jìn)而抑制其下游抑癌通路的激活。

首先作者通過分析The Cancer Genome Atlas 數(shù)據(jù)庫中的乳腺癌樣本，運(yùn)用基因集富集分析(GSEA)，發(fā)現(xiàn)乳酸代謝活躍的腫瘤中P53信號(hào)通路呈現(xiàn)抑制狀態(tài)。

接著，通過在細(xì)胞模型中加入乳酸鈉以及敲除乳酸脫氫酶A (LDHA)的方法，進(jìn)一步證實(shí)了乳酸對(duì)P53通路的抑制作用，并通過乳酸化特異性抗體檢測到P53乳酸化水平升高，但P53的基因表達(dá)和蛋白水平未受影響，暗示乳酸化主要影響P53的功能而非其表達(dá)。

為了找出調(diào)控P53乳酸化的基因，作者采用了CRISPR基因編輯技術(shù)進(jìn)行全基因組篩選，最終鑒定出丙氨酰-tRNA合成酶1 (AARS1)作為乳酸化過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶。

通過敲減和過表達(dá)AARS1，作者驗(yàn)證了P53的乳酸化修飾依賴于AARS1。結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析表明，AARS1能識(shí)別乳酸并催化乳酸-AMP復(fù)合物的形成，隨后將乳酸轉(zhuǎn)移至P53的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域上的特定賴氨酸殘基(K120和K139)，這一修飾阻止了P53的液-液相分離(LLPS)、DNA結(jié)合以及受調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄激活，從而抑制P53的作用。

最后，作者對(duì)這一機(jī)制進(jìn)行了藥物干預(yù)試驗(yàn)，旨在尋找能夠逆轉(zhuǎn)P53乳酸化或抑制AARS1活性的化合物，以期為乳腺癌和其他與P53失活相關(guān)的癌癥提供新的治療策略。
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.腫瘤源性乳酸是一種天然的p53抑制因子，可促進(jìn)p53的乳酸化

作者首先利用TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA分析，發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞P53通路被抑制（A）；通過乳腺癌小鼠模型檢測腫瘤乳酸及P53水平，再敲除LDHA來正反面證明乳酸確實(shí)抑制了P53通路。

再使用乳酸化抗體檢測P53乳酸化水平上調(diào)，但其基因與蛋白表達(dá)并未受到影響，于是推測乳酸化抑制了其功能而不調(diào)節(jié)其表達(dá)。由此引出下一個(gè)問題，是那個(gè)基因在什么位點(diǎn)調(diào)節(jié)這一現(xiàn)象？
2.全基因組CRISPR篩選鑒定AARS1介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞中賴氨酸的乳酸化
作者通過全基因組CRISPR篩選并測序鑒定發(fā)現(xiàn)了丙氨酰-tRNA合成酶1（AARS1）。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析觀察到整體賴氨酸乳酸化在AARS1基因敲低后受到抑制，而AARS1的過表達(dá)顯著增強(qiáng)了整體的賴氨酸乳酸化水平。
3.AARS1直接結(jié)合乳酸并以ATP依賴的方式促進(jìn)賴氨酸乳酸化

為進(jìn)一步探究AARS1如何介導(dǎo)的賴氨酸乳酸化，通過分子對(duì)接模型預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)再點(diǎn)突變篩選結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸或ATP結(jié)合缺陷的HsAlaRS突變體未能增加賴氨酸乳酸化水平。隨后乳酰轉(zhuǎn)移驗(yàn)證AARS1催化乳�；鶊F(tuán)的轉(zhuǎn)移至賴氨酸殘基及AARS1的結(jié)合位點(diǎn)。

4.通過催化TP依賴的乳酸-AMP的形成，AARS1將乳酸轉(zhuǎn)移到賴氨酸上的共價(jià)綴合物

蛋白質(zhì)組學(xué)篩選鑒定了與p53相互作用的蛋白質(zhì)，分析p53與HsAlaRS和EcAlaRS的結(jié)合親和力。在HsAlaRS過表達(dá)并經(jīng)乳酸鈉刺激的細(xì)胞中，p53在K120和K139位點(diǎn)被乳酸化。

乳酸在AARS1的催化下被ATP激活，形成乳酸-AMP中間體，伴隨PPi的釋放。加入p53作為底物會(huì)導(dǎo)致乳酸-AMP的消耗和AMP的產(chǎn)生，表明AARS1催化ATP依賴性的乳酸-AMP形成，進(jìn)而將乳酸共價(jià)轉(zhuǎn)移到目標(biāo)蛋白的賴氨酸上。
5.p53的位點(diǎn)特異性乳酸化減弱了它們的DNA結(jié)合和液-液相分離(LLPS)，從而降低了p53在體內(nèi)和體外的腫瘤抑制作用

作者進(jìn)一步探究了p53在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)中K120和K139位點(diǎn)的乳酰化對(duì)p53活性的影響，以及如何通過遺傳密碼擴(kuò)增策略產(chǎn)生位點(diǎn)特異性的乳酸化p53蛋白。通過p53的相分離、遺傳密碼擴(kuò)增策略、LacK摻入p53證實(shí)了這些乳�；问降膒53與p53 RE-DNA的結(jié)合親和力顯著下降，影響了p53的液滴形成和轉(zhuǎn)錄激活能力。

體內(nèi)模型實(shí)驗(yàn)也證實(shí)乳酸化的P53具有更高的致瘤性。
6.模擬乳酸化的疾病相關(guān)K120和K139變體表現(xiàn)出降低的LLPS和抑制腫瘤生長的能力

通過分析TP53基因數(shù)據(jù)庫和COSMIC，確定了幾個(gè)癌癥相關(guān)熱點(diǎn)突變，其中K120和K139位點(diǎn)的變異最為突出。

突變將帶正電荷的賴氨酸替換為不帶電荷（如Asn、Thr、Gln）或帶負(fù)電荷（如Glu）的氨基酸，從而模擬乳酸化效果。結(jié)合試驗(yàn)顯示K120和K139位點(diǎn)的突變減少了p53與RE-DNA的結(jié)合親和力，其中K至E突變的影響尤為顯著。液-液相分離（LLPS）實(shí)驗(yàn)說明突變體的LLPS能力受損，這是p53活性的一個(gè)重要方面。

在HCT116細(xì)胞系中，野生型p53能夠抑制細(xì)胞增殖和腫瘤生長，而K120 E和K139 E突變體則失去了這種能力。綜上結(jié)果證實(shí)了K120和K139變異體具有LLPS降低和抑制腫瘤生長的能力。
7.在腫瘤生長過程中，AARS1介導(dǎo)的p53乳酸化可以被β-丙氨酸拮抗

在敲除乳腺上皮特異性AARS1的乳腺癌動(dòng)物模型中，AARS1表達(dá)降低延緩了腫瘤發(fā)展，減少了原發(fā)性腫瘤負(fù)荷。其乳酸濃度與腫瘤負(fù)荷呈顯著正相關(guān)。

患者來源的腫瘤組織樣本顯示，AARS1表達(dá)和蛋白質(zhì)組乳酸化（包括p53的乳酸化）水平在惡性腫瘤中顯著上調(diào)。這一結(jié)果也證實(shí)了在TCGA腦腫瘤樣本中AARS1表達(dá)與p53活性呈顯著負(fù)相關(guān)這一分析結(jié)果。由此表明，在人類癌癥中，AARS1調(diào)控著包括p53乳酸化在內(nèi)的全局賴氨酸乳酸化。
β-丙氨酸能夠抑制細(xì)胞增殖、克隆形成和異種移植腫瘤生長，其效果在加入多柔比星（Dox）后顯著增強(qiáng)，后者是一種激活p53的遺傳毒性藥物。經(jīng)β-丙氨酸處理的小鼠腫瘤中檢測發(fā)現(xiàn)p53乳酸化水平降低，且β-丙氨酸聯(lián)合Dox治療顯著延長了小鼠的壽命。這表明β-丙氨酸可能通過防止p53的乳酸化依賴性失活，具有潛在的治療應(yīng)用價(jià)值。
4 小結(jié)
這篇文章做的非常完整，從發(fā)現(xiàn)AARS1作用p53蛋白到機(jī)制研究，再到針對(duì)該機(jī)制的藥物干預(yù)探索，思路清晰，加入新技術(shù)應(yīng)用，完美符合頂刊偏好。想要研究乳酸化修飾如何發(fā)表高分文章，這篇具有一定的借鑒意義。

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