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科研顧問_Gu新蟲 (小有名氣)
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文獻(xiàn)分享 | IF=14.7，Nature Communications：非腫瘤鐵死亡思路看這里~
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“鐵死亡”這個熱點真的是老生常談了，是不是很多小伙伴都覺得它早已過時？其實，越是如此，能發(fā)高分越是難能可貴，遇到這種高分思路，咱們越是不能放過！ 6月份，中山三院楊揚教授團隊就從肝缺血/再灌注損傷入手發(fā)了一篇Nature communications！研究首次提供了鐵死亡在老年肝臟缺血/再灌注損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用，抑制鐵死亡可以有效減輕老年肝缺血/再灌注損傷。而且，研究結(jié)合了臨床樣本分析、動物模型和體外細(xì)胞實驗，提供了從分子機制到潛在治療應(yīng)用的全面視角。所以，能不能發(fā)高分最關(guān)鍵的就是選題新不新，獨不獨特。時至今日，會一些生信分析技能也是非常重要的，大家應(yīng)該發(fā)現(xiàn)了，大部分的高分文章都是干濕結(jié)合的，同樣，今天分享的這篇文章也用到了生信分析。所以，對發(fā)表高分文章有需求的小伙伴，滿足這兩點就成功了一大半。 題目：老年肝臟中FTO缺乏通過上調(diào)ACSL4和TFRC加劇缺血/再灌注損傷期間的鐵死亡 雜志：nature communications 影響因子：IF=14.7 發(fā)表時間：2024年6月 研究背景 肝缺血/再灌注損傷(HIRI)在肝移植(LT)過程中不可避免地發(fā)生，HIRI使患者易出現(xiàn)早期同種異體移植物功能障礙(EAD)和移植后的排斥反應(yīng)。老年肝臟相對更容易發(fā)生IRI，這嚴(yán)重限制了老年肝臟在LT中的利用。因此，迫切需要揭示IRI的潛在分子機制，以促進開發(fā)有效減輕老年肝臟IRI的新治療方法。 由于老年肝臟更容易發(fā)生脂質(zhì)紊亂和線粒體衰竭，并且隨著年齡的增長，鐵離子在肝臟中進一步積累，作者推測老年肝臟更容易發(fā)生鐵死亡。然而，鐵死亡在老年人HIRI中的作用尚不清楚，揭示潛在的調(diào)節(jié)機制對于開發(fā)有效的治療方法來減輕老年人HIRI至關(guān)重要。 該研究中，作者通過臨床標(biāo)本和體內(nèi)和體外實驗評估了鐵死亡在老年HIRI中的關(guān)鍵作用。 研究結(jié)果 年齡較大的肝臟比年輕的肝臟更容易發(fā)生IRI，并表現(xiàn)出更多的鐵死亡 作者在人類原位肝移植(OLT)隊列(n=20)中評估了供體年齡及其與肝損傷的關(guān)系。與年輕組（<50歲）相比，老年組（≥50歲）術(shù)后第1天(POD1)血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平較高，而從POD1到POD7的血清AST和ALT水平恢復(fù)較慢。此外，HE染色和TUNEL染色顯示，老年肝臟組織學(xué)變化更明顯，肝細(xì)胞死亡增加。這些結(jié)果證明，年齡較大的肝臟確實更容易發(fā)生IRI，但潛在的調(diào)節(jié)機制尚不清楚。 結(jié)合老年肝臟的生理變化和鐵死亡的特點，作者推測老年肝臟更容易發(fā)生鐵死亡。結(jié)果顯示，在再灌注后的老年肝臟中，ROS的積累明顯高于年輕肝臟，ROS是引發(fā)鐵死亡的重要因素。老年肝臟的脂質(zhì)過氧化程度高于年輕肝臟。此外，分析了與鐵死亡相關(guān)的多個關(guān)鍵蛋白，發(fā)現(xiàn)在再灌注后的老年肝臟中，抑制鐵死亡的NRF2、GPX4和FTH1的表達(dá)水平明顯降低，而促進鐵死亡的分子ACSL4和TFRC則相反過表達(dá)。 體內(nèi)實驗結(jié)果證實，年齡較大的肝臟更容易發(fā)生IRI，血清AST和ALT水平升高，肝臟結(jié)構(gòu)保存不良，細(xì)胞死亡增加。作者還檢測了各組小鼠肝組織中鐵死亡水平。雙氫乙酯(DHE)分析、C11 BODIPY染色、透射電鏡(TEM)分析和western blotting分析進一步證明，老年肝臟中鐵死亡的發(fā)生率高于年輕肝臟。 抑制鐵死亡可顯著緩解老年HIRI 基于這些發(fā)現(xiàn)，作者試圖進一步探討鐵死亡在老年HIRI中的作用。結(jié)果顯示，鐵抑素-1 (Fer-1)可顯著緩解老年HIRI，表現(xiàn)為血清AST和ALT水平降低，肝臟結(jié)構(gòu)保存相對較好，細(xì)胞死亡減少，并且在IR期間，F(xiàn)er1可強烈減弱老年肝臟中ROS的積累和脂質(zhì)過氧化。此外，體外表征的結(jié)果證實了鐵死亡在老年HIRI中的作用。Calcein-AM/ PI雙染色、DHE染色和C11 BODIPY染色顯示，用Fer1處理細(xì)胞抑制鐵死亡可顯著改善H/R對老年肝細(xì)胞的損傷。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明抑制鐵死亡可以強烈減輕老年HIRI。 m6A去甲基化酶FTO在老年HIRI中下調(diào) 為了進一步確定影響老年HIRI的因素，作者使用液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)篩選年輕HIRI和老年HIRI之間差異表達(dá)蛋白。主成分分析(PCA)結(jié)果顯示，幼鼠和老齡鼠的肝臟樣本基本可以獨立分組，說明各組之間確實存在差異。肝臟中多種蛋白的表達(dá)隨年齡的變化而變化。 接下來，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)從蛋白質(zhì)譜中篩選出參與老年HIRI調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子  1)年輕和老年肝臟組織之間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能與老年肝臟對IRI易感性增加有關(guān);(2) IR過程中表達(dá)改變的蛋白也可能參與了這一過程;(3) IR期間僅在老年肝臟中表達(dá)變化的蛋白。最終鑒定出FTO、n-乙�；D(zhuǎn)移酶8(NAT8)和肌動蛋白結(jié)合LIM蛋白1 (ABLIM1) 3個分子。通過western blotting和IHC檢測人和小鼠肝組織中FTO和NAT8的表達(dá)，結(jié)果顯示，老年肝臟和衰老肝細(xì)胞中FTO水平明顯低于年輕，IR后進一步降低。與FTO不同，NAT8的表達(dá)不隨年齡或IR發(fā)生顯著變化。因此，最終關(guān)注的是FTO，它可能是調(diào)節(jié)老年HIRI的關(guān)鍵因素。Dot blotting實驗顯示，與FTO表達(dá)水平相比，m6A甲基化水平在HIRI期間上調(diào)，并且隨著年齡的增長更為明顯�？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)TO的下調(diào)可能通過m6A甲基化的調(diào)節(jié)參與了老年HIRI的調(diào)節(jié)。 FTO通過抑制鐵死亡改善老年HIRI 為了闡明FTO對老年HIRI的影響，作者首先在臨床上測量了OLT后供肝中FTO水平與血清肝功能之間的相關(guān)性。如圖4a、b所示，F(xiàn)TO高表達(dá)的OLT受者在POD1處血清AST和ALT水平較低，并且在POD1- pod7處AST和ALT水平迅速恢復(fù)，這表明FTO可能減輕老年肝臟的IRI。 為了進一步驗證鐵死亡在FTO緩解HIRI中的作用，將Fer1和FB23-2聯(lián)合治療較老的HIRI模型，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組的情況略遜于Fer1組，明顯優(yōu)于FB23-2組，抑制鐵死亡可以顯著逆轉(zhuǎn)老年HIRI中FTO失活的影響。此外，C11 BODIPY染色、TEM檢測和western blotting結(jié)果證明，IR期間，F(xiàn)er-1顯著消除了FTO介導(dǎo)的鐵死亡調(diào)節(jié)，這也表明FTO對老年HIRI的緩解主要是通過調(diào)節(jié)鐵死亡來實現(xiàn)的。 在體外實驗中，erastin是一種有效的鐵死亡激活劑，用于證實鐵死亡在FTO介導(dǎo)的老年HIRI緩解中的作用。在H/R過程中，F(xiàn)erry-1對鐵死亡的抑制顯著逆轉(zhuǎn)了FTO失活對細(xì)胞死亡、細(xì)胞內(nèi)ROS積累和脂質(zhì)過氧化的影響，這與體內(nèi)實驗結(jié)果一致，而用erastin處理則產(chǎn)生相反的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)進一步表明，F(xiàn)TO介導(dǎo)的老年HIRI緩解主要是通過調(diào)節(jié)鐵死亡來實現(xiàn)的。 FTO通過m6A去甲基化抑制ACSL4和TFRC mRNA的穩(wěn)定性 為了探索FTO調(diào)控鐵凋亡的潛在機制，對轉(zhuǎn)染對照質(zhì)�；騀TO過表達(dá)質(zhì)粒并進行H/R的衰老THLE2細(xì)胞進行了甲基化RNA免疫沉淀測序(MeRIP-seq)。MeRIP-seq在FTO過表達(dá)組和對照組之間共發(fā)現(xiàn)1689個差異的峰。其中，49.38%的差異豐度峰的m6A修飾水平下調(diào)，另有50.62%的差異豐度峰的m6A修飾水平上調(diào)。對下調(diào)的峰進行了功能富集分析，發(fā)現(xiàn)這些峰富集于鐵死亡相關(guān)通路中。ACSL4和TFRC可誘導(dǎo)鐵死亡，被預(yù)測為FTO的潛在靶點。過表達(dá)FTO顯著降低Acsl4的5'UTR和Tfrc的3'UTR的m6A修飾水平。然后，采用MeRIP-qPCR檢測Acsl4和Tfrc的m6A修飾的變化。結(jié)果顯示，F(xiàn)TO過表達(dá)可降低Acsl4和Tfrc的m6A水平。為了進一步驗證FTO可以靶向Acsl4和Tfrc，作者還進行了FTO-CLIP-seq。Acsl4和Tfrc中FTO富集的區(qū)域與FTO過表達(dá)后m6A修飾水平顯著降低的區(qū)域重疊，這進一步表明FTO可以結(jié)合Acsl4和Tfrc降低兩者的m6A修飾。 接下來，通過RT-qPCR和western blotting檢測FTO介導(dǎo)的m6A修飾是否會影響ACSL4和TFRC的表達(dá)，結(jié)果顯示，過表達(dá)FTO會抑制ACSL4和TFRC的表達(dá)，而沉默F(xiàn)TO或抑制其去甲基化酶活性則會顯著逆轉(zhuǎn)這種影響。 基于m6A修飾對mRNA穩(wěn)定性和衰變的調(diào)節(jié)作用，作者檢測了與放線菌素d共培養(yǎng)后Acsl4和Tfrc mRNA的半衰期。觀察到，F(xiàn)TO的過表達(dá)導(dǎo)致Acsl4和Tfrc mRNA半衰期縮短。最終發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO可以通過去除轉(zhuǎn)錄后m6A修飾縮短Acsl4和Tfrc mRNA的半衰期，最終降低Acsl4和Tfrc的表達(dá)。 FTO通過鐵死亡介導(dǎo)的老年HIRI緩解以ACSL4和TFRC依賴的方式發(fā)生 為了探討ACSL4和TFRC在FTO介導(dǎo)的老年HIRI緩解中的作用，作者通過尾靜脈注射嗜肝腺相關(guān)病毒(AAV8)誘導(dǎo)老年小鼠短期和短暫下調(diào)ACSL4或TFRC的表達(dá)。此外，將FB23-2用于這兩種AAV8預(yù)處理的模型，結(jié)果表明，敲低ACSL4或TFRC不僅能有效緩解老年HIRI，而且能顯著逆轉(zhuǎn)FB23-2在這些模型中的作用。這些結(jié)果表明，F(xiàn)TO的肝保護潛力取決于其對ACSL4和TFRC的調(diào)節(jié)。 在體外，衰老肝細(xì)胞中ACSL4或TFRC的過表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)了FTO介導(dǎo)的細(xì)胞死亡減少、細(xì)胞內(nèi)ROS積累以及IR期間脂質(zhì)過氧化。相反，ACSL4或TFRC的下調(diào)顯著削弱了FTO沉默或FB23-2治療的效果。這些體內(nèi)和體外數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)TO以依賴于其對ACSL4和TFRC的調(diào)節(jié)的方式減輕了老年HIRI。 NMN通過增強FTO的去甲基化酶活性來緩解老年HIRI NMN是NAD+的重要前體之一，已被批準(zhǔn)用于抗衰老治療。在此，作者想知道NMN是否可以作為緩解FTO相關(guān)m6A的老年HIRI的有效治療方法。從血清肝酶水平、H&E染色和TUNEL染色的變化可以看出，NMN治療顯著改善了老年HIRI。此外，m6A點印跡實驗顯示，在IR期間，NMN顯著下調(diào)老年肝臟中m6A修飾水平，證實NMN可以增強FTO的去甲基化酶活性。最后，DHE染色、C11 BODIPY染色、western blotting和TEM分析進一步證明了NMN抑制鐵死亡的潛力�？偟膩碚f，數(shù)據(jù)顯示FTO-ACSL4 /TFRC調(diào)控通路有助于老年HIRI的發(fā)病機制，NMN可以增加FTO去甲基化酶活性以改善老年HIRI。這些結(jié)果可能有助于臨床轉(zhuǎn)化，以減輕老年供體的IRI LT患者。 文章小結(jié) 總之，研究證明通過NMN增強FTO去甲基化酶活性可以通過降低ACSL4和TFRC的表達(dá)來緩解老年HIRI，這兩種分子都是導(dǎo)致鐵死亡的關(guān)鍵分子。需要進行進一步的臨床試驗來評估NMN對OLT中接受老年肝臟患者肝功能改善的作用。鐵死亡不僅可以用在腫瘤方面，如果非腫瘤疾病尤其是一個研究比較少的疾病結(jié)合該熱點也是一個不小的創(chuàng)新，因而也能發(fā)一篇高質(zhì)量的文章。 |
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