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科研顧問(wèn)_Gu新蟲(chóng) (小有名氣)
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干貨分享 | 電泳驗(yàn)證，RNA品質(zhì)一目了然——拒絕空談，用事實(shí)說(shuō)話(huà)！
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前言：最近中科院遺傳所許同學(xué)有個(gè)疑問(wèn)：他提出來(lái)的RNA儀器數(shù)據(jù)很好，就是熒光定量做不出來(lái)，是什么原因呢？ 數(shù)據(jù)是真漂亮 我建議他跑電泳后再聊，下面是對(duì)應(yīng)的電泳圖： 完全降解！這樣的RNA質(zhì)量能做出來(lái)熒光定量才怪呢 所以：不跑電泳就談RNA質(zhì)量好壞的，都是耍流氓！因?yàn)閮x器NarnoDorp2000不能區(qū)分DNA和RNA，完全降解的RNA也能讀出高純的OD比值和高濃度數(shù)據(jù)，所以?xún)x器數(shù)據(jù)在RNA電泳圖合格的前提下才有參考意義！ 下面只從RNA電泳圖，談?wù)勅绾闻袛郣NA的質(zhì)量： 總RNA的提取方法主要分兩種： Trizol沉淀法和RNA吸附柱法。 一、Trizol沉淀法的判斷標(biāo)準(zhǔn)：28:18s比例至少為1.5:1 用異丙醇沉淀，或者乙醇沉淀方法提取的RNA，因?yàn)?s小片段也可以一起沉淀，所以，一般會(huì)見(jiàn)到明顯的5s條帶，用這種方法提取見(jiàn)到5s條帶，是正常的，不提示降解。 這個(gè)圖片來(lái)源于農(nóng)科院作物所楊老師，Marker左邊是invitrogen的Trizol; marker右邊是我們的RNAzol。都是上樣3uL，由于RNA濃度過(guò)高(~5000ng/UL)，電泳條帶都快分不開(kāi)了。 二、RNA吸附柱法的判斷標(biāo)準(zhǔn)有兩個(gè)： 第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：28s:18s=2:1 這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的意思是28s、18s是否清晰，條帶寬度28s是18s的2倍，尤其是亮度，28S比18s越亮越好。因?yàn)榻到�，總是從大片段開(kāi)始降解，從28s降解到18s，最后降解到5s。這樣降解過(guò)程中，28s減少，18s增多，28s：18s比例就會(huì)下降。如果最容易降解的28s都沒(méi)有降解，那么，就推理出：mRNA是完好的了。 第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：5s帶不出現(xiàn) 總RNA=mRNA+tRNA+rRNA，即：總RNA就是指mRNA、tRNA、rRNA的總和。這個(gè)概念是在還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)microRNA的時(shí)候的產(chǎn)生的，卻被各大RNA提取試劑盒生產(chǎn)公司所默認(rèn)，一直延續(xù)至今。也就是說(shuō)在市場(chǎng)上你看到的“總RNA提取試劑盒”，只對(duì)mRNA、tRNA、rRNA負(fù)責(zé)，提出來(lái)的是這三種RNA的混合物，重點(diǎn)是對(duì)mRNA負(fù)責(zé)。所以各位可以去各大公司的網(wǎng)站，看一看總RNA提取試劑盒案例所配的RNA電泳圖，只有代表“總RNA”的2條帶——28s和18s；代表microRNA的5s帶，要不沒(méi)有，要不很弱。這就是目前各個(gè)公司總RNA提取試劑盒中“總RNA”的概念。 下面這張圖片就是一個(gè)不同降解情況的典型例子(RNA吸附柱法)。 泳道2是完全正常的RNA——大家可以看到28s:18s比例大約是2:1，5s位置也基本見(jiàn)不到帶。這就說(shuō)明完全正常，無(wú)降解。 泳道3,4是完全降解了——28s，18s已經(jīng)基本降解光了。兩條帶都看不見(jiàn)了。最后降解成的小片段正好和5s大小一致，所以在5s位置看到了大量的一條濃濃的降解小片段。 泳道1,5,6,7,8,9 部分降解了——28s是RNA大片段，更容易降解，所以28s首先降解，表現(xiàn)為28s條帶變淡，18s條帶明顯變粗，造成28s：18s的比例竟然小于1了。然后在不該看到條帶或者應(yīng)該是很弱的5s位置，出現(xiàn)了較明顯的5s大小的降解帶。 |
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