 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 736 | 回復(fù): 0 | |||
18317190548新蟲 (小有名氣)
|
[交流]
實(shí)驗(yàn)操作 | 小白第一課！基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)方法及步驟 | MedChemExpress (MCE)
|
|
7_f4GjribL6oKPUQCJqVtpibiassFwQA.png 和細(xì)胞第一次見面的時(shí)候我們要做好什么準(zhǔn)備呢？快跟著小M 一起看看吧~ ▐ 01 記錄細(xì)胞重要信息 當(dāng)?shù)谝淮卧趯?shí)驗(yàn)室接收細(xì)胞系時(shí)，有幾條與細(xì)胞系有關(guān)的信息應(yīng)該被整理和記錄，這些將確保細(xì)胞系的成功繁殖、擴(kuò)增、冷凍保存和儲存。小 M 強(qiáng)烈建議在細(xì)胞擴(kuò)增開始之前記錄以下信息：(1) 背景信息，(2) 傳代培養(yǎng)，(3) 冷凍保存，(4) 細(xì)胞系儲存。 表 1. 需要記錄與細(xì)胞系有關(guān)的信息[1]。 注意：細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，連續(xù)細(xì)胞系在培養(yǎng)中會發(fā)生變化。然而，許多研究已經(jīng)證明了長期培養(yǎng)對細(xì)胞系形態(tài)、發(fā)育和基因表達(dá)的各種影響：如細(xì)胞生長變異，導(dǎo)致細(xì)胞污染等。因此，當(dāng)?shù)谝淮螌⒓?xì)胞系接收到實(shí)驗(yàn)室時(shí)，留有低傳代的細(xì)胞種子庫是非常重要的。▐ 02 培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察監(jiān)測和記錄細(xì)胞形態(tài)和行為是十分重要的，推薦做法是在傳代培養(yǎng)之前定期仔細(xì)地檢查培養(yǎng)細(xì)胞，以確定其狀態(tài)和健康狀況。細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果可以幫助“科研汪”們判斷 (1) 細(xì)胞的形態(tài)：健康 or 惡化 (即衰老或壞死的細(xì)胞)？(2) 是否存在細(xì)胞污染？(3) 區(qū)分細(xì)胞及細(xì)胞密度。大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)生長為：懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)。然而，在某些情況下可能會觀察到懸浮和貼壁的混合群體。 培養(yǎng)中的動(dòng)物細(xì)胞的形狀可分為三個(gè)基本形態(tài)：成纖維細(xì)胞樣(Fibroblast-like)、上皮細(xì)胞樣(Epithelial-like) 和類淋巴母細(xì)胞樣(Lymphoblastoid-like)。 圖 1. 培養(yǎng)細(xì)胞的一般特征和形狀[1]。 (A) 上皮樣 (貼壁)；(B) 成纖維細(xì)胞樣 (貼壁)；(C) 淋巴母細(xì)胞樣 (懸浮液)。 13_Q0Tk5Mv21098agAozGBnnFOpja5BLA.png (以收到 T25 培養(yǎng)瓶為例) 1. 先觀察培養(yǎng)基顏色以及是否有漏液情況，再在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照，排除細(xì)胞本身污染或狀態(tài)不好的情況； 2. 確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)正常后將細(xì)胞瓶外壁消毒，放在培養(yǎng)箱靜置數(shù)小時(shí) (根據(jù)細(xì)胞密度定) 以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)； 3.1 貼壁細(xì)胞：細(xì)胞生長密度超過 80% 時(shí)，可根據(jù)情況傳代，若細(xì)胞未超過80%匯合度時(shí)，可對其培養(yǎng)基進(jìn)行半換液處理，即吸去一半的原培養(yǎng)基 (不要丟掉可以留給細(xì)胞過渡用)，再加入等量的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直至細(xì)胞密度超過 80% 以后再進(jìn)行傳代； 3.2 懸浮細(xì)胞：將細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)液體轉(zhuǎn)移至離心管，500 g 離心 5 min，溫柔的倒出上清液 (也可以先保留下來以備不時(shí)之需)，管底細(xì)胞沉淀加入 10 mL 完全培養(yǎng)基吹打、重懸。放入新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜，根據(jù)細(xì)胞密度及生長情況分瓶傳代。 圖 2. 臺盼藍(lán)染色圖[2]。 4. 細(xì)胞計(jì)數(shù)：無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液稀釋到 200-2000 個(gè)/毫升，在 10-100 µl 的細(xì)胞懸液中加入等體積的 0.4% 的臺盼藍(lán)溶液。輕輕混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。活細(xì)胞排斥臺盼藍(lán)，依舊是透亮的狀態(tài)，死細(xì)胞會被染成藍(lán)色。有細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的，可直接用計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)更方便哦~ 16_v1CRHImFBD1XGuXaHFib7icd65BHwg.png 選擇合適的培養(yǎng)基對于細(xì)胞培養(yǎng)的成功至關(guān)重要，不同類型的細(xì)胞具有不同的生長需求和特定的培養(yǎng)條件。首先，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)是維持細(xì)胞生長和代謝所必需的。不同類型的細(xì)胞需要各種不同的氨基酸、糖類、維生素、無機(jī)鹽和脂質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)以滿足其生理需求。如果培養(yǎng)基中缺乏必要的營養(yǎng)物質(zhì)，細(xì)胞可能無法正常生長和分裂，甚至?xí)䦟?dǎo)致細(xì)胞死亡[3][4]。選擇合適的培養(yǎng)基的時(shí)候優(yōu)先根據(jù)細(xì)胞來源公司提供的培養(yǎng)條件，無法確定來源的可以參考 ATCC 推薦細(xì)胞對應(yīng)培養(yǎng)基。表 2. 常見細(xì)胞的培養(yǎng)體系。 其次，不同類型的細(xì)胞需要特定的生長因子和激素來維持其特定的功能和特性。例如，神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基中通常添加神經(jīng)營養(yǎng)因子 ，以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長和突觸形成；胎牛血清 通常被添加到培養(yǎng)基中，提供細(xì)胞所需的生長因子、蛋白質(zhì)和其他重要組分。 此外，必要時(shí)候也可以加入抗生素來防止污染保衛(wèi)細(xì)胞。例如雙抗 (青霉素/鏈霉) 甚至三抗 (青霉素、鏈霉素、兩性霉素 B) 以抑制細(xì)菌和真菌等微生物的生長，青霉素-鏈霉素可有效抑制多數(shù)革蘭氏陽性菌 和革蘭氏陰性菌的生長，兩性霉素 B 可用于抑制真菌、酵母的污染。 18_wTZh7vJm0rPaYgic2LRvOe1gjTaXBw.png 隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞的數(shù)量會增加，而空間和資源卻有限。所以，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定密度時(shí)，就該考慮給他們一個(gè)更廣闊的居住空間，讓他們繼續(xù)昌盛繁衍。 圖 3. 傳代流程圖。 常見的細(xì)胞傳代步驟參考如下： (以 T25 培養(yǎng)瓶為例) 1. 從培育箱中取出細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞，匯合度大于 80% 即可傳代； 2. 準(zhǔn)備操作：培養(yǎng)基和 PBS 放置 37℃ 水浴鍋預(yù)熱，將傳代所用耗材(移液管、移液槍、T25 培養(yǎng)瓶、槍頭等) 放入超凈工作臺，紫外滅菌 30 min 后通風(fēng)，將胰酶和預(yù)熱后的培養(yǎng)基以及 PBS 用 75% 酒精消毒后放入超凈工作臺； 3. 吸棄培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液，5 mL PBS 潤洗細(xì)胞，吸棄 PBS； 4. 加入 1 mL 胰蛋白酶，輕晃培養(yǎng)瓶使胰蛋白酶充分覆蓋細(xì)胞，放入 37℃ 培養(yǎng)箱中孵育 30 s-2 min (實(shí)際孵育時(shí)間因所使用的細(xì)胞系而異)； 5. 顯微鏡下觀察，當(dāng) ≥90% 的細(xì)胞脫落時(shí)，加入兩倍胰酶體積的含血清的完全培養(yǎng)基，終止消化，吹打細(xì)胞層表面數(shù)次，使其分散成單個(gè)細(xì)胞； 6. 500× g 離心 3-5 分鐘，將細(xì)胞沉淀重懸于含血清的完全培養(yǎng)基； 7. 將細(xì)胞懸液按傳代比例分裝到培養(yǎng)瓶，補(bǔ)充新鮮完全培養(yǎng)基，輕晃培養(yǎng)瓶使細(xì)胞分布均勻，并做好標(biāo)記； 8. 顯微鏡下觀察細(xì)胞密度及狀態(tài)，把細(xì)胞送回培養(yǎng)箱。 注意：利用胰蛋白酶進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)需要考慮許多因素。胰蛋白酶具有水解蛋白質(zhì)的活性，可影響細(xì)胞的多種生理代謝功能。 Tips：胰蛋白酶傳代培養(yǎng)細(xì)胞的最佳方法 在添加胰蛋白酶之前，用不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的生理鹽水/PBS 清洗，以去除這些離子 (溶液中的 Ca2+、Mg2+ 和血清會降低胰酶活力)； 用最低濃度和體積的胰蛋白酶從培養(yǎng)瓶表面去除細(xì)胞； 如果可能的話，在室溫或更低的溫度下使用胰蛋白酶溶液，以減少酶的內(nèi)吞作用； 盡可能短的時(shí)間使用胰蛋白酶處理細(xì)胞，避免消化過度影響細(xì)胞； 用胰蛋白酶抑制劑如含血清或血清的完全培養(yǎng)基中和終止胰蛋白酶活性，然后用離心除去胰蛋白酶； 細(xì)胞脫落后立即離心除去培養(yǎng)瓶表面的胰蛋白酶。 21_iayL8CQ2icd1T2ADwc7Ok4YTUxVQEQ.png 細(xì)胞凍存就像是給細(xì)胞一個(gè)冰凍的時(shí)間旅行機(jī)票，保證它們在未來可以“解凍”回到活力四溢的狀態(tài)。這一過程可以確保你的珍貴細(xì)胞庫不會因?yàn)闀r(shí)間的推移而遭受損失。 那么凍存細(xì)胞的最佳時(shí)機(jī)是什么時(shí)候？什么樣的細(xì)胞濃度合適？要用多少凍存液呢？怎么實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的“慢凍”？復(fù)蘇后第二天發(fā)現(xiàn)細(xì)胞沒有活？好不容易復(fù)蘇的細(xì)胞竟然污染了？怎么才能讓細(xì)胞滿血復(fù)活呢？ [1] Reid YA. Best practices for naming, receiving, and managing cells in culture. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2017 Oct;53(9):761-774. [2] Aung S M, et al. Live and dead cells counting from microscopic trypan blue staining images using thresholding and morphological operation techniques[J]. International Journal of Electrical and Computer Engineering, 2019, 9(4): 2460. [3] Jessica Cox, et al. Co-occurrence of Cell Lines, Basal Media and Supplementation in the Biomedical Research Literature. Journal of Data and Information Science. 2020, Vol. 5. Issue (3) : 161-177. [4] Lee JT, et al. Cell culture medium as an alternative to conventional simulated body fluid. Acta Biomater. 2011 Jun;7(6):2615-22. [5] Yee Y, et al. Mechanism of penicillin-streptomycin synergy for clinical isolates of viridans streptococci[J]. The Journal of infectious diseases, 1986, 154(3): 531-534. [6] Baust, et al. Development and Assessment of a Novel Device for the Controlled, Dry Thawing of Cryopreserved Cell Products. BioProcessing Journal. 2016;15. 30-41. |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
推薦一些20種氨基酸檢測的實(shí)際應(yīng)用案例
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有61人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 18317190548 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 材料328求調(diào)劑 +8 | 一個(gè)蘿卜02 2026-03-03 | 8/400 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 0703 東華大學(xué) 理學(xué)化學(xué)均過 a 線，總分 281 求調(diào)劑 +3 | 香香 Lu 2026-03-03 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 材料085600 303求調(diào)劑 +6 | 1bygone 2026-03-04 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿武漢理工大學(xué)-085602-總分296分-求調(diào)劑 +7 | 紫川葡柚 2026-03-04 | 7/350 |
|
|
[考研] 267化工調(diào)劑求助 +5 | 聰少OZ 2026-03-04 | 5/250 |
|
|
|
[基金申請]
 本子寫完了，給DS兄弟看了，得了92分
+4
|
Doma 2026-03-01 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 一志愿天津大學(xué)085600 319分 材料與化工 金屬方向 求調(diào)劑 +5 | 青科11 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿鄭州大學(xué)，學(xué)碩，物理化學(xué)， 333求調(diào)劑 +5 | 李魔女斗篷 2026-03-04 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 085600 材料與化工 298 +14 | 小西笑嘻嘻 2026-03-03 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 281求調(diào)劑 +3 | Y?l?h 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 331求調(diào)劑 +3 | zzZ&zZ 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 接收調(diào)劑 +15 | 津萌津萌 2026-03-02 | 23/1150 |
|
|
|
[考研] 291求調(diào)劑 +4 | Afy123456 2026-03-03 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)306調(diào)劑 +4 | 26要上岸 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工調(diào)劑 280分 +10 | yyqqhh 2026-03-03 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 284求調(diào)劑 +6 | 天下熯 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 268求調(diào)劑 +6 | 好運(yùn)連綿不絕 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 085600材料工程一志愿中科大總分312求調(diào)劑 +9 | 吃宵夜1 2026-02-28 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 264求調(diào)劑 +4 | 巴拉巴拉根556 2026-02-28 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 311求調(diào)劑 +9 | 南迦720 2026-02-28 | 10/500 |
|