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科研顧問_Gu新蟲 (小有名氣)
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干貨分享 | 流式細胞術，也可以如此簡單！
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圖片 文獻中我們經(jīng)常能看見這種圖，也就是流式結果分析圖，美觀、簡單、一目了然。 流式細胞術（flow cytometry）是20世紀60年代后期開始發(fā)展起來的利用流式細胞儀快速定量分析細胞群的物理化學特征以及根據(jù)這些物理化學特征精確分選細胞的新技術，主要分為流式分析和分選2部分。 今天我們主要介紹流式分析中基本操作與技巧，首先簡要了解一下什么是流式細胞術。 一、流式細胞術的3大要素 1. 流式細胞儀：現(xiàn)在市面上有多種型號的流式細胞儀，但其基本結構都是相同的，分析性流式細胞儀有液流系統(tǒng)、光路系統(tǒng)、監(jiān)測分析系統(tǒng)。 （1）液流系統(tǒng) 圖片 （2）光路系統(tǒng) 光路系統(tǒng)始于激光器，其分類分法很多，最常用的分類方法是根據(jù)其發(fā)射的激光的波長來分，如常見的有488nm的藍激光器、635nm的紅激光器和405nm的紫激光器，不同的激光器發(fā)出的激光照射到細胞后產生的光信號會經(jīng)過不同的光路系統(tǒng)被不同的通道接收。 流式細胞儀采集的光信號包括散射光信號和熒光信號，散射光信號也就是我們常說的FSC（前向散射光，反應細胞的大�。�、SSC（側向散射光，反應細胞的復雜程度）；熒光信號是細胞上結合有熒光素，被激光激發(fā)以后，會發(fā)射熒光信號。 圖片 （3）檢測分析系統(tǒng)： 流式細胞儀的檢測分析系統(tǒng)就是以通道為單位將細胞的各個通道的光信號匯總分析，最后得出樣品群體中細胞的物理化學特征。 通道，我們可以理解為就是光電倍增管，有2個作用： ①將光信號轉變?yōu)殡娮有盘枺?br /> ②放大電子信號�？梢苑譃樯⑸涔馔ǖ溃‵SC通道、SSC通道）和熒光通道，一個激光器下可以有多個熒光通道，一個通道對應多個熒光染料，例如以beckman的DXflex機器的638nm紅激光器為例，APC通道可以接收 APC、Alexa Fluor647、eFluor660熒光信號，原則上，這3種熒光素不能同時標記一個樣品，否則，就無法分析該通道上的信號是來自于哪種熒光素。 另一個重要組成部分就是計算機分析系統(tǒng)，例如BD的DIVA系統(tǒng)。 圖片 二、樣品細胞：流式細胞術檢測的對象一般是細胞，并且是呈獨立狀態(tài)的懸浮于液體中的細胞，如果要檢測組織中的細胞，必須先將組織制備成單細胞懸液。 三、熒光偶聯(lián)抗體：樣品細胞只有標記熒光素偶聯(lián)抗體進而被激光照射后才能發(fā)射熒光信號，從而得到樣品細胞表達某抗原分子強弱等情況。 二、流式細胞術的基本操作與技巧 1）細胞的制備、培養(yǎng) 2）封閉 3）熒光素偶聯(lián)抗體標記 4）光電倍增管電壓的設定 5）對照的設置 6）補償調節(jié) 以體外培養(yǎng)的PBMC細胞為例： 1、細胞培養(yǎng)在96孔板中，直接收集細胞于1.5ml的EP管中，350g，4°C離心5min，棄上清； 2、然后用1ml FACS buffer重懸沉淀，350g，4°C離心5min，棄上清； 3、封閉：標記樣品細胞的熒光素偶聯(lián)抗體多為單克隆抗體，少數(shù)也可能是多克隆抗體，其基本結構都由兩部分組成，即包含有特異性結合抗原位點的Fab段和相對保守的Fc段，抗體的特異性表現(xiàn)在Fab段，標記時利用Fab段的抗原結合位點與細胞上抗原分子特異性結合，從而標記并且相對量化細胞表達該抗原分子的情況。但是，有些細胞表面表達FcR(Fc receptor, Fc受體），如巨噬細胞、DC、B淋巴細胞等， FcR可以與熒光素偶聯(lián)抗體的Fc段進行非特異性的結合，對結果產生一定的影響。 封閉方法1：取適量的血清全IgG抗體與樣品細胞充分混勻，4'C靜置15min。研究人的細胞時，若熒光素偶聯(lián)抗體來源于小鼠，封閉采用小鼠血清全IgG抗體。原則是，如果流式抗體可能與樣品細胞的FcR發(fā)生非特異性結合，那么在標記熒光素偶聯(lián)抗體之前先用流式抗體同源的全IgG抗體進行封閉，使樣品細胞表面的FcR飽和。 封閉方法2：適量的抗CD16和抗CD32單克隆抗體與樣品細胞充分混勻，4'C靜置 15min。CD16是一種FcR, 能夠與IgG的Fc段結合，親和力較強；CD32也是一種 FcR, 能夠與IgG的Fc段結合，親和力中等。而熒光素偶聯(lián)抗體基本上是IgG抗體，所以在標記熒光素偶聯(lián)抗體前可以用抗CD16和抗CD32單克隆抗體封閉樣品細胞，使樣品細胞表面的FcR都被抗CD16 或抗CD32單克隆抗體結合，從而阻止后續(xù)熒光素偶聯(lián)抗體與FcR的非特異性結合。 圖片 4、標記相應的熒光素偶聯(lián)抗體，這里以CD3-APC-Cy7、CD4-FITC為例，一般染色體系推薦100μl，CD3、CD4表達量相對較高，1μl足夠了，假如有9個樣本，分別取10μlCD3-APC-cy7、CD4-FITC加到含有990μl的1.5ml的EP管中，混勻后，分別取100μl加到9個樣品孔中，混勻，室溫、避光染色20min； 5、加1ml FACS buffer洗去未結合的抗體，350g，4°C離心5min，棄上清，用200μl FACS buffer或2%的多聚甲醛重懸沉淀，盡快上機分析。 6、電壓的設定：上機分析時，確認機器沒有問題后，首先就是調節(jié)每個通道的光電倍增管的電壓，目的是為了區(qū)分細胞群，假如我們想研究人的淋巴細胞群，我們都知道人的PBMC含有淋巴細胞、單核細胞還有中性粒細胞等，那我們怎么把它們分開呢？這時候就要用到我們前面提過的FSC和SSC，通過調節(jié)FSC和SSC的電壓，區(qū)分淋巴細胞亞群，原則就是使樣品細胞或者目標細胞位于流式圖的中央或者靠近中央的位置。FSC和SSC的電壓確定之后就開始調節(jié)APC-cy7、FITC的電壓（我們可以在鋪細胞的時候多鋪一個孔，染色時將CD3-APC-cy7、CD4-FITC均染上，用于FSC、SSC、APC-cy7、FITC電壓的調節(jié)），原則就是使陽性細胞群和陰性細胞群盡可能的分離。 圖片 7、對照的設置： 流式實驗中對照設置很重要，常見的有陰性對照、FMO對照、補償單陽管對照。 （1）陰性對照：每一種細胞都會產生非特異性熒光，流式檢測時得到的熒光信號是細胞本身的非特異性熒光和來自于細胞表面結合的熒光素的特異性熒光疊加得到的結果。所以，確定與熒光素無關的細胞自身的非特異性熒光的強弱非常重要，此時就需要設立陰性對照。下圖3類陰性對照是比較全面的陰性對照，但我們實驗中設置陰性對照不需要3種陰性對照全部設置齊全，一般只需要設置1種陰性對照就可以了，推薦第1類或第3類。 ① 第1類"negative"表示 的是不加任何熒光素偶聯(lián)抗體時得到的熒光信號，即“blank”因為沒有標記任何熒光素，所以這組得到的熒光信號與熒光素無關，與細胞抗原分子是否表達無關，得到的熒光信號代表的是非特異性熒光信號（當實驗要求不高、已進行預實驗或者能夠確定同型對照的熒光信號與不加同型對照的這種陰性對照結果一致時，就可以采用這種陰性對照的設置）； ② 第2類“抗CD69"表示的是用抗CD69抗體標記樣品細胞后得到的熒光信號，雖然抗CD69抗體能夠與細胞表面的CD69抗原分子結合，但是抗CD69抗體沒有偶聯(lián)熒光素，所以得到的熒光信號也與細胞表面是否表達有CD69分子無關，得到的熒光信號代表的也只是細胞本身的非特異性熒光，所以這種對照用于排除抗體的影響（第2種陰性對照設置方法只是一種理論上的設置方法，是為了便于理解陰性對照的設置原理，一般流式分析時不會應用到這種陰性對照）； ③ 第3類"IgG1-PE"表示的是標記與抗CD69抗體同種屬（來源于同一物種）且同類（抗CD69-PE中的抗體是IgGl類的）的非特異性抗體(IgGl)與PE熒光素偶聯(lián)的同型(isotype)對照抗體(IgGl-PE)后，得到的熒光信號，這種同型對照抗體不能與細胞表面的CD69 發(fā)生特異性結合，所以細胞表面不會結合有IgGl-PE, 最后得到的熒光信號不是PE熒光素產生的特異性熒光信號，而是代表細胞本身的非特異性熒光，所以這種對照用于排除熒光素的影響（第3種陰性對照的設置方法，稱為同型對照設置，是常規(guī)的陰性對照設置法，正式的流式圖的數(shù)據(jù)都必須建立在這種同型對照的基礎之上，在同型對照基礎上得出的流式結果是最可靠的，尤其是對于一些陰陽分群不明顯的情況下，可將同型對照作為劃門的依據(jù)）。 圖片 （2）FMO（fuorescence-minus-one control）對照：即減去一個熒光抗體（一般是表達量低、背景熒光干擾強），其它組合不變，是一種特殊的陰性對照，多在研究不同細胞亞群表達某些重要的表型分子、細胞因子等時應用。如Foxp3 FMO，也就是不加Foxp3-PE，只加入CD4、CD25，與三個染料都加組相比，多出來的那部分就是Treg細胞群。 圖片 （3）補償單陽管對照：以上面我們提到的CD3-APC、CD4-FITC為例，在這里，我們要設置PE單染管和FITC單染管，用于補償?shù)恼{節(jié)，一般單染管要求有明顯的陽性細胞群，像CD3、CD4表達量都很高，陽性細胞群明顯，但對一些抗原表達弱的情況（陽性細胞群基本看不到），例如CD25，這時候有必要借助補償微球。 圖片 總結 常見對照的作用 圖片 三、注意事項 （1）在細胞制備、培養(yǎng)階段，如果該培養(yǎng)細胞是貼壁細胞，需用先用胰酶消化細胞，然后收集待測樣品細胞，離心、洗滌、封閉后標記熒光素偶聯(lián)抗體即可。 （2）如果是胸腺、脾臟和淋巴結等外周免疫器官，主要由免疫細胞組成，制成單細胞懸液，只需直接將臟器經(jīng)鋼網(wǎng)研磨即可。 （3）如果是實體臟器肺臟、肝臟和腫瘤組織內含有較多的結締組織，實體臟器細胞之間一般結合緊密，所以直接研磨臟器法無法得到理想的單細胞懸液。因此，研磨前需將臟器剪碎后加入IV型膠原酶和DNA核酸內切酶消化，消化后的組織再用研磨棒直接研磨。實體臟器研磨后的單細胞懸液以實體細胞為主，如果研究目標不是實體細胞，而是臟器內浸潤的免疫細胞，可以用Percoll密度梯度離心法富集免疫細胞，然后再進行流式分析。 （4）調節(jié)電壓時，如果檢測的目標細胞體積較小，可以適當提高電壓值，使目標細胞與細胞碎片在流式圖中能夠完全分離；如果檢測的目標細胞體積較大，可以適當降低電壓值，使所有的目標細胞群完整顯示于流式圖中，防止細胞群接近于流式圖的邊界而變形扭曲或者完全處于邊界外。 （5）關于樣本的封閉，并不是標記熒光素偶聯(lián)抗體之前必須封閉樣品，一般樣品細胞與流式抗體的種屬來源是不同的，如標記人的細胞的熒光素偶聯(lián)抗體一般來源于小鼠，人細胞的FcR也不一定能夠與小鼠來源的熒光素偶聯(lián)抗體的Fc段結合，但是，也有可能因為種屬關系較近，或者在一定環(huán)境條件下這種不同種屬間的Fc段和FcR也能結合，實驗者很難判斷實驗過程中這種結合是否會發(fā)生，但是在標記熒光素偶聯(lián)抗體前封閉樣品卻可以保證這種非特異性結合一定不會發(fā)生。所以，條件允許的話，實驗者最好養(yǎng)成封閉樣品的習慣。 |
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