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科研顧問_Gu新蟲 (小有名氣)
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干貨分享 | 8種常見的核酸提取方法
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基因作為生物遺傳信息的載體，通過基因檢測，大眾能夠發(fā)現(xiàn)身體內(nèi)潛在的疾病風(fēng)險(xiǎn)，及早采取有效的預(yù)防或者干擾措施。基因是遺傳的基本單元，是產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的DNA片段。 而做好基因研究的第一步就是獲取核酸，核酸提取通常是開啟生物學(xué)研究的第一步，而且提取的核酸質(zhì)量高低也是決定下游實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素之一。無論后續(xù)的克隆、PCR、QPCR、建庫測序等等都需要核酸才能順利進(jìn)行。今天我們就來簡單了解核酸提取的基本原理和方法。 什么是核酸? 核酸分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。DNA主要集中在細(xì)胞核內(nèi)，線粒體和葉綠體中，而RNA主要分布在細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中。 核酸作為基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象。無論是進(jìn)行核酸的結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先都需要對(duì)核酸進(jìn)行提取和純化。核酸提取為大量廣泛研究和應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。 核酸提取的基本步驟 1、裂解細(xì)胞，釋放核酸。使用裂解液破壞樣品細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而使樣品中的DNA游離在裂解體系中; 2、核酸的分離與純化。需要將與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子和其他不需要的核酸分子去除; 3、核酸的濃縮、沉淀; 4、純化核酸。純化則是使DNA與裂解體系中的其它成分，如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離的過程。 核酸提取純化原則和要求 1、需要保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性，為下游實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備; 2、排除其它核酸分子的污染(提取DNA時(shí)排除RNA的干擾，反之亦然); 3、核酸樣品中沒有對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和高濃度的金屬離子; 4、將核酸樣品中其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染降到最低程度。 核酸提取純化的常見方法 (一)核酸提取按照提取方式可分為手工提取和通量較高的自動(dòng)化提取。 (二)按照提取原理有如下方法： 煮沸裂解法 此法一般用于DNA的手工提取。染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大很多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)裝分子;當(dāng)加熱處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉合的質(zhì)粒DNA在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象;變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。 煮沸裂解法提取DNA，得量少，雜質(zhì)多，DNA可能會(huì)出現(xiàn)斷裂，主要適用于一些粗略的實(shí)驗(yàn)。 酚氯仿抽法 此法是DNA提取的經(jīng)典方法，主要是使用兩種不同的有機(jī)溶劑交替抽提將蛋白去除。用苯酚處理勻漿液時(shí)，由于蛋白與DNA的聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶，同時(shí)苯酚抑制了DNase的降解作用，蛋白質(zhì)分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀DNA。離心后，DNA可取出。 酚氯仿抽提最大的優(yōu)勢是成本低，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較低。提取的DNA保持天然狀態(tài)。獲得的DNA純度高、片段大、效果好，缺點(diǎn)是操作較為繁瑣。 濃鹽法 高鹽沉淀法是酚氯仿抽提方法的一個(gè)變種，利用RNP和DNP在電解溶液中溶解度不同，將二者分離。優(yōu)點(diǎn)事省略了酚氯仿抽提操作的麻煩，并且?guī)缀蹩朔朔勇确鲁樘岱椒ǖ囊磺腥秉c(diǎn)，只是得到DNA的純度不夠穩(wěn)定。 陰離子去污劑法 用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性，可以直接從生物材料中提取DNA。由于細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合，同時(shí)陰離子去污劑能夠破壞這種價(jià)鍵，所以常用陰離子去污劑提取DNA。 SDS法操作簡單、溫和，也可提取到較高分子量 DNA ，但所得產(chǎn)物含糖類雜質(zhì)較多。 異硫氰酸胍/苯酚法(Trizol法) Trizol法是提取RNA的經(jīng)典方法，在勻質(zhì)化或溶解樣品中，Trizol試劑可保持RNA的完整性，同時(shí)又能破壞細(xì)胞及溶解細(xì)胞成分。加入氯仿離心后，裂解液分層成水相和有機(jī)相。RNA存在于水相中。水相轉(zhuǎn)移后，RNA通過異丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可從中間相沉淀得到DNA，加入異丙醇沉淀可從有機(jī)相得到蛋白質(zhì)。 Trizol法適用于普通的植物組織、動(dòng)物組織以及真菌和細(xì)菌等的RNA提取實(shí)驗(yàn)。 CTAB法原理(植物DNA提取經(jīng)典方法) CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨)，是一種陽離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。 離心柱純化 通過特殊硅基質(zhì)吸附材料，能夠特定吸附DNA，而RNA和蛋白質(zhì)順利通過，然后利用高鹽低PH結(jié)合核酸，低鹽高PH值洗脫，來分離純化核酸。離心柱純化也是試劑盒提取中廣泛的使用方法。 離心柱法DNA提取試劑盒價(jià)格較低，操作相對(duì)簡單，在市面上應(yīng)用較為廣泛。但是其具有樣本需求量大，損失多，對(duì)于珍稀樣本無能為力，同時(shí)不便于高通量、自動(dòng)化操作等劣勢。 磁珠法提取 磁珠法利用了磁性顆�；钚曰鶊F(tuán)在一定條件下可與核酸結(jié)合和解離的原理，先使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，帶有活性基團(tuán)的磁性顆�？商禺愋晕綇募�(xì)胞中游離出來的核酸分子，而樣品中的其他干擾物則很好的移除了，在磁場作用下，磁性顆粒與液體分開完成，最后回收顆粒(即磁珠-DNA 混合物)，再用洗脫液洗脫即可得到純凈的DNA，獲得質(zhì)量較高的核酸模板。 磁珠法不需要離心、無需加入多種試劑，操作簡單，符合核酸自動(dòng)化提取要求。但是成本較高，科研端使用很難普及。 |
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