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干貨分享 | 菌種保藏的常見方法匯總
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菌種保藏是指保持微生物菌株的活力和遺傳性狀的技術(shù)。微生物在使用和傳代過程中容易發(fā)生污染、變異甚至死亡，因而常常造成菌種的衰退。菌種保藏的目的就是使菌株存活、不丟失、不污染雜菌、不發(fā)生或少發(fā)生變異，保持菌種原有的活性和各種特征。菌種保藏的基本原理是使微生物的生命活動處于半永jiu性的休眠狀態(tài)，也就是將微生物的新陳代謝作用限制在最低范圍內(nèi)。 實(shí)驗(yàn)室常用的保菌方法有：甘油保菌法、斜面保菌法、穿刺保菌法、液體石蠟覆蓋保藏法、沙土保藏法、冷凍干燥法。微基生物在以上幾種菌種保藏方法的基礎(chǔ)上，開發(fā)出了保菌效果更好瓷珠保菌法。 一、甘油保菌法 此方法適用于菌種的中長期保藏，保藏時間可在1年以上。由于甘油本身十分粘稠，很難定量，因此一般將甘油和生理鹽水按1:1的比例配成終濃度為50%的甘油溶液。使用時，按50%甘油：菌液=1:1的比例混合，使甘油終濃度在20-30%即可，甘油濃度過高或過低都不利于菌種保藏。將甘油菌種轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱長期凍存。需要取用菌種的時候，將凍存管放在37℃水浴中快速解凍，直到菌種完全融化，此時可取出菌種進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 此方法適用范圍廣，操作簡單，保藏期長，菌種不容易發(fā)生變異。 二、斜面保菌法 將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生長后轉(zhuǎn)移至4℃冰箱中保藏。保藏的時間根據(jù)微生物的種類而不同，一般霉菌、放線菌及產(chǎn)芽孢的細(xì)菌保存2-4個月就需要移種一次，酵母菌為兩個月，而細(xì)菌最好一個月移種一次。需要取用菌種的時候，可用接種環(huán)在斜面上挑取少量菌體進(jìn)行接種。 此方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，使用方便，不需特殊設(shè)備，能隨時檢查所保藏的菌株是否死亡、變異或污染雜菌等。缺點(diǎn)是保藏期短，菌種容易變異，因?yàn)榕囵B(yǎng)基的物理和化學(xué)性質(zhì)不是嚴(yán)格恒定的，屢次傳代會使微生物的代謝發(fā)生改變，且此方法污染雜菌的機(jī)會較高。 三、穿刺保菌法 準(zhǔn)備一管半固體培養(yǎng)基，用接種針挑取菌種，自半固體培養(yǎng)基的中心垂直刺入，直至接近試管底部，但不要穿透，然后沿原穿刺線將接種針退出，于4℃冰箱保存。此方法同斜面保菌法一樣需要定期移種。 四、液體石蠟覆蓋保藏法 此方法是斜面保菌的輔助方法。將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生長后注入無菌液體石蠟，使其覆蓋整個斜面，再直立放置在4℃冰箱中保藏。液體石蠟可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，同時可以讓菌體與空氣隔絕，減弱菌種的代謝作用，延長保藏時間。需要取用菌種時，用接種環(huán)從斜面上挑取少量菌種即可。 此方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，不需要特殊的設(shè)備，且不需要頻繁移種，保藏時間較長。缺點(diǎn)是保存時必須直立放置，占用空間較大。 五、沙土保藏法 將培養(yǎng)好的菌種與無菌沙土混合，使菌體吸附在沙土載體上，干燥后轉(zhuǎn)移至4℃冰箱保存。需要取用菌種的時候，取出少量沙土顆粒即可。 此方法操作簡單，菌種的保藏時間長。 六、冷凍干燥法 將菌種冷凍，在減壓下利用升華作用去除水分，使細(xì)胞的生理活動趨于停止，從而使菌種長期維持存活的狀態(tài)。需要取用菌種的時候，用無菌水或培養(yǎng)基重懸菌體，將菌懸液轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)。 此方法適用于菌體的長期保存，但是相關(guān)的設(shè)備和操作相對其他幾種保藏方法都比較復(fù)雜。 七、瓷珠保菌法 微基生物在以上幾種保藏方法的基礎(chǔ)上開發(fā)出了瓷珠保菌法，相對傳統(tǒng)的保藏方法保菌的效果更好，而且取用方便，可降低菌種因反復(fù)凍融而受到的傷害。 瓷珠凍存管中包含12顆磨砂瓷珠和菌種保存液。挑取對數(shù)生長期的菌種轉(zhuǎn)移至凍存管中，上下顛倒混勻，此時菌種會均勻分布在保存液中。用移液器吸出保存液，此時在表面張力的作用下，每顆瓷珠表面都會覆蓋一層保存液，而菌種就保存在這層保存液中。將含有菌種的凍存管轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱即可長期凍存（一般可保存約1年）。 需要取用菌種時，從-80℃冰箱中取出凍存管，輕輕搖晃使瓷珠分散開，挑取一顆瓷珠接種至培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，或接種至液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖菌培養(yǎng)。接種完成后，迅速將凍存管放回冰箱中。 針對厭氧菌株，我們也能夠提供含有還原劑的厭氧性保存液，并對菌種采用真空包裝，避免菌種因接觸氧氣而死亡。 菌種保藏的方法很多，但原理大同小異。 首先要挑選優(yōu)良純種。利用微生物的孢子、芽孢及營養(yǎng)體； 其次，根據(jù)其生理、生化性，人為創(chuàng)造低溫、干燥或缺氧等條件，抑制微生物的代謝作用，使其生命活動降低到極低的程度或處于休眠狀態(tài)，從而延長菌種生命以及使菌種保持原有的形狀，防止變異。不管采用哪種保藏方法，在菌種保存過程中要求不死亡、不污染雜菌和不退化。 短期：斜面保藏 斜面保藏是目前最普遍的短期保藏法，操作簡單，使用方便，但需定期接種。因此工作量較大，而且傳代次數(shù)多易發(fā)生變異，因此，僅適用于短期經(jīng)常使用的菌種。 1. 配制培養(yǎng)基，營養(yǎng)成分濃度稍低為宜，特別是糖類盡可能降低，產(chǎn)酸菌種，則應(yīng)添加少量碳酸鈣； 2. 斜面裝液量，斜面以傾斜后不超過試管長度 1/2 為宜； 3. 斜面培養(yǎng)，溫度較最適稍低，時間較最適略長； 4. 生長完成后，密封置于 2~8℃的冰箱中保藏。每傳代一次，霉菌、放線菌及有芽孢的細(xì)菌可保存 1~3 個月，酵母菌 2 個月，細(xì)菌1個月。 活化使用： 將斜面從冰箱中取出，細(xì)菌挑取菌落增菌，或霉菌切塊傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)好即可使用。 長期：冷凍保藏 冷凍保藏是目前使用較為廣泛的長期保藏法之一，適用于所各類微生物，較之于斜面保藏，減少了工作量，延長了保藏時間。 1. 準(zhǔn)備斜面或平板新鮮培養(yǎng)物一個，10%的無菌甘油溶液； 2. 用甘油溶液將菌體或孢子洗脫下來，形成菌懸液； 3. 菌懸液分裝，凍存管裝液 1mL/支，后置于程序降溫盒； 4. 將程序降溫盒置于-80℃冰箱凍存； 5. 可保藏 1-2 年。 活化使用： 1. 將凍存菌株置于凍存盒中取出，準(zhǔn)備水浴溶解，切勿常溫融化； 2. 將菌株迅速置于水浴速溶，細(xì)菌 40℃，真菌 30℃，約 2min 全部溶解后接種到適宜培養(yǎng)基； 3. 采用適宜條件培養(yǎng)完成即可。 |
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