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專業(yè): 臨床藥理

[交流] 終極攻略 | WB內參的選擇

內參即是內部參照（Internal Control），對于哺乳動物細胞來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白（Housekeeping Proteins），它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。

一
為什么要使用內參呢？
Western blot除了能證明某樣品含有某種蛋白之外，其最為重要的作用是比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達量的相對多少。即為蛋白表達水平最直接的證據(jù)。要衡量蛋白的表達水平，前提條件就是等量的上樣量。

然而如果僅將蛋白濃度測定作為規(guī)范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的唯一方法，顯然是不可取的。

首先各種蛋白質濃度定量方法都存在局限性，不能完全準確的確定各種樣品的蛋白濃度。如UV法直接定量，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質，相對于比色法來說，操作簡單，但是容易受到平行物質如DNA的干擾，且敏感度低，要求蛋白的濃度較高。比色法測定蛋白濃度一般有BCA、Bradford、Lowry等幾種方法。BCA法與Lowry法都容易受到蛋白質之間以及去污劑的干擾。Bradford法敏感度最高，且與一些列干擾Lowry、BCA反應的還原劑（如DTT、巰基乙醇）相溶，但是對去污劑依然是敏感的，其最主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結果差異較大，無可比性。另外，蛋白質定量以后進行電泳時需要等量上樣，此步驟也存在操作誤差。在Western Blot實驗時使用內參，即可簡便地對定量和上樣步驟產(chǎn)生的誤差進行校正。

在Western Blot中使用內參其實就是在WB過程中另外用內參對應的抗體檢測內參，這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時可以檢測內參的表達，由于內參在各組織和細胞中的表達相對恒定，借助檢測每個樣品內參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結果才更為可信。此外使用內參可以作為空白對照，檢測蛋白轉膜情況是否完全、整個Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。

二
如何選擇合適的內參呢？
有些人提取蛋白會選擇胞漿、胞核分開提取，不提取總蛋白。β-actin在胞漿中表達高效穩(wěn)定，而總蛋白主要成分就是胞漿蛋白，所以β-actin可以作為總蛋白的內參。理論上細胞核內不表達β-actin，所以不能用于核蛋白內參。同理，細胞核內的蛋白用于做總蛋白內參，自然也不合理，內參自當選擇與目的蛋白表達部位相同的蛋白才能有說服力。

而實際情況中，無論什么試劑盒，都不可能完全將胞漿、胞核蛋白完全分離開，提取時總會有交叉污染。即提取的核蛋白肯定會有β-actin，而胞漿蛋白也會有核蛋白的存在，所以你用兩種蛋白做內參都能有結果，只是有的科學合理，有的不科學，沒有說服力。

此外很多公司的內參抗體是用抗原片段制備的，不同的公司選擇的片段不一樣。以最常用的β-actin為例，有的公司選擇N端，有的選擇C端。選用N端的抗體均不能檢測心肌和橫紋肌中的actin條帶。選用C端的抗體可以在肌肉細胞中檢測到actin陽性信號。有時候在實驗中檢測內參時產(chǎn)生“組織特異性”，就是由于抗體選擇不對造成的。

那么應該如何選擇合適的內參呢，一般遵循以下原則：

1
樣本種屬來源

首先要考慮的就是實驗樣本來源于什么物種。哺乳動物的組織或者細胞樣本，通常選擇β-actin、Tubulin、GAPDH、Lamin B、PCNA、Na+/K+-ATPase等。植物來源實驗樣本則可以選擇Plant actin、Rubisco等。其他來源樣本研究較少，所以就應該參照文獻報道，選擇合適的蛋白作為內參。

2
目的蛋白分子量

選擇內參抗體時，應該考慮目的蛋白分子量的大小。通常應該保證目的蛋白與內參蛋白分子量相差5KD以上。比如檢測目的蛋白分子量為45KD，此時不適宜選擇β-actin（42KD）作為內參，可以考慮選擇GAPDH（36KD）作為內參。

3
目的蛋白表達部位

a、胞漿和全細胞蛋白：β-actin（43KD）、GAPDH（37KD）、Tubulin（55KD）等；

b、胞核蛋白：PCNA（29KD）、Histone H3（17KD）等；

c、核膜蛋白：Lamin B（66KD）等；

d、胞膜蛋白：Na+/K+-ATPase（120KD）等；

e、線粒體蛋白：COX IV（17KD）、VDAC1（30KD）等。

4
實際的實驗環(huán)境

有些細胞在某些條件下內參表達會出現(xiàn)異常，使其不適合做內參。比如某些細胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會導致GAPDH的表達增高，不適合做內參。在凋亡實驗時，Lamin等也不適合作為內參。在加入抗癌和抗真菌藥物時，Tubulin的表達易受影響，不適合作為內參。Lamin B不適合作為胚胎干細胞的內參，而PCNA不適合作為非增殖細胞的內參等。因此設計實驗方案的時候應該考慮這些因素并查詢相應文獻，在實驗過程中也應該注意如果內參表達出現(xiàn)異常，應考慮這方面因素。

5
不同的組織特異性

actin 即肌動蛋白，是細胞的一種重要骨架蛋白。actin 大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余兩種廣泛分布于各種組織中，包括beta-actin（β-non-muscle）和gamma-non-muscle actin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的，在肌肉組織中beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的組織本來就應該選擇不同的內參，不能一概而論。

三
Western Blot中怎樣使用內參呢？
在Western Blot實驗過程中使用的內參的方法有：

超級簡便的標記內參使用法：只要在二抗孵育時加入HRP標記內參抗體（一抗孵育時不加抗體，即HRP直接標記于內參一抗上），按照正常操作即可。

普通內參：當目的蛋白的分子量大小與選用的內參蛋白分子量相差不大時，可以先進行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測。然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進行內參蛋白的抗體溫育、顯色檢測。

當目的蛋白的分子量大小與選用的內參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉膜后預染，根據(jù)蛋白質Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分，使內參蛋白與目的蛋白分開。然后兩塊膜分別與內參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進行溫育，二抗溫育以及顯色。

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