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科研顧問_Gu新蟲 (小有名氣)
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干貨分享 | RACE，跑步？no，是cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)！
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一、RACE簡介 本指南描述了新藥申請或生物制劑許可申請藥效綜合匯總的建議內(nèi)容。雖然生物制劑許可申請?zhí)峤恢袥]有要求藥效綜合匯總，申請者最好能提供藥效綜合匯總，因?yàn)樗梢员憩F(xiàn)一致性評價(jià)和藥物的優(yōu)點(diǎn)。 本指南中的建議反映了FDA 目前關(guān)于信息的想法，一份藥效綜合匯總應(yīng)當(dāng)包含行業(yè)信息以提供完整的分析，該分析提供臨床試驗(yàn)上可觀察到之外的見解。本指南不適用于《公共衛(wèi)生服務(wù)法》監(jiān)管下的生物制品醫(yī)療器械。 藥效數(shù)據(jù)綜合匯總代替了第二章G部分，行業(yè)指南"臨床和統(tǒng)計(jì)部分申請的格式和內(nèi)容指南"。它還包含了2.7.3部分的概念框架和臨床療效的總結(jié)， ICH行業(yè)指南CTD格式M4E一一療效。 二、經(jīng)典RACE 1、3´-RACE 3´-RACE是利用真核生物mRNA的3´端具有polyA結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，使用5´端帶有接頭序列的oligodT與之結(jié)合進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。 再利用根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的上游引物和與接頭序列互補(bǔ)配對的下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到cDNA的3´末端擴(kuò)增產(chǎn)物。 引物一：oligo(dT)17和一個(gè)35bp的接頭(dT17-adaptor)，；引物二：一個(gè)基因特異性引物，擴(kuò)增的特異性取決與其cDNA分子互補(bǔ)。引物三：接頭引物，用接頭引物來取代dT(17)-adaptor則可阻止長(dT)堿基引起的錯(cuò)配。 2、5´-RACE 5´-RACE是利用根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的下游引物GSP作為逆轉(zhuǎn)錄引物，合成一鏈cDNA；再用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶和dATP在新合成的cDNA的3'末端加上polyA。 接著用帶有接頭序列的OligodT引物與一鏈cDNA的3'末端的polyA結(jié)合，合成二鏈cDNA；再以第二鏈cDNA為模板，利用GSP和接頭引物作為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到cDNA的5'末端擴(kuò)增產(chǎn)物。 三、Adapter-Ligated RACE 在獲得mRNA的過程中或多或少會(huì)產(chǎn)生很多斷裂的mRNA短片段，Adapter-Ligated RACE技術(shù)是為了獲得更長的mRNA序列，但相對來說不一定能獲得全長mRNA序列。 Adapter-Ligated RACE是利用T4連接酶將接頭連接到cDNA的兩個(gè)末端上；在PCR循環(huán)的退火步驟中，由于短cDNA的退火溫度低，兩端接頭容易發(fā)生退火，形成鍋柄狀結(jié)構(gòu)，阻止引物與模板的結(jié)合，終止PCR反應(yīng)。長的cDNA退火溫度高，不易形成鍋柄裝結(jié)構(gòu)，因此引物可以與接頭結(jié)合，可進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 四、RLM-RACE RLM-RACE技術(shù)同樣是為了解決mRNA斷裂的副反應(yīng)，利用斷裂的mRNA的5´端沒有帽子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，首先在RNA體系中加入牛小腸堿性磷酸酶(CAP)，特異性地識(shí)別并切除斷裂的mRNA 5'端暴露的磷酸基團(tuán)；再向體系中加入煙草酸性焦磷酸酶(TAP)，切除mRNA 5'端完整的帽子結(jié)構(gòu)，使mRNA 5'端暴露出一個(gè)磷酸基團(tuán)。 接著加入RNA連接酶將接頭與mRNA 5'端暴露的磷酸基團(tuán)連接，而切除了磷酸基團(tuán)的斷裂RNA則不能與接頭結(jié)合，這樣便獲得了5'端帶有接頭的完整mRNA；最后再進(jìn)行RT-PCR。 1、mRNA“帽子”結(jié)構(gòu) 帽子結(jié)構(gòu)的化學(xué)本質(zhì)是mRNA轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生修飾所形成的位于mRNA 5'端的一個(gè)特殊結(jié)構(gòu)，即m7GPPPN結(jié)構(gòu)，又稱甲基鳥苷帽子。 它是在RNA三磷酸酶，鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶，mRNA(鳥嘌呤-N7)甲基轉(zhuǎn)移酶和mRNA(核苷-2´  甲基轉(zhuǎn)移酶共同催化作用下形成的。甲基化程度的不同可形成3種帽子：Cap0型、Cap1型和Cap2型。2、煙草酸性焦磷酸酶 煙草酸性焦磷酸酶可用于水解像mRNA 5´-Cap這樣特殊結(jié)構(gòu)的磷酸二酯鍵，釋放出的mRNA的5´端只帶有一個(gè)磷酸基團(tuán)。 煙草酸性焦磷酸酶是第一個(gè)被純化出來的能夠在酸性溶液中保持活性的磷酸酶。(堿性磷酸二酯酶常為從胡蘿卜、甜菜和蛇毒中獲得，在堿性條件和金屬離子存在的情況下能夠保持活性的。) TAP還可用于以下方面： ①放射性標(biāo)記RNA。RNA被煙草酸性焦磷酸酶去除掉帽子結(jié)構(gòu)，并被Apex磷酸酶去磷酸后，就能夠用T4多核苷酸激酶和γ-[³²P]-腺苷三磷酸對其末端進(jìn)行標(biāo)記。 ②RNA 5´端轉(zhuǎn)換。即除了能夠去除mRNA帽子結(jié)構(gòu)外，煙草酸性焦磷酸酶還能夠?qū)NA的5´端三磷酸酯轉(zhuǎn)換為單磷酸。 3、mRNA脫帽酶(MDE) MDE可以將mRNA 5´´末端的7-甲基鳥苷帽(m7G)結(jié)構(gòu)去除，產(chǎn)生5´單磷酸末端并釋放m7GDP。mRNA 脫帽酶能夠使各種長度的mRNA脫帽，對Cap0和 Cap1的去除效率相同。mRNA脫帽酶也可將5´三磷酸末端轉(zhuǎn)化為5´單磷酸，但轉(zhuǎn)化效率相對較低。 五、Cap-switching RACE Cap-switching RACE是以O(shè)ligo dT作為逆轉(zhuǎn)錄引物，逆轉(zhuǎn)錄獲得一鏈cDNA；當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄到mRNA的5'帽子結(jié)構(gòu)時(shí)，莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV)會(huì)在新合成的cDNA的3'末端加上若干個(gè)胞嘧啶。 接著，使用5'端帶有接頭、3'端帶有polyG結(jié)構(gòu)的接頭引物與cDNA 3'端的polyC互補(bǔ)配對，逆轉(zhuǎn)錄酶繼續(xù)以接頭為模板合成cDNA，完成接頭轉(zhuǎn)化，新合成的一鏈cDNA 3'端就含有一段接頭序列；然后再利用接頭引物進(jìn)行PCR獲得RACE產(chǎn)物。 莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶所催化的加尾反應(yīng)是依賴模板和帽子結(jié)構(gòu)的存在的，只有完整的cDNA末端才會(huì)加上胞嘧啶殘基。 六、環(huán)形-RACE 環(huán)形RACE技術(shù)(cRACE)，是針對克隆只有部分序列已知的mRNA而設(shè)計(jì)的。cRACE利用polyT引物進(jìn)行RTPCR反應(yīng)擴(kuò)增第一條cDNA，經(jīng)過RNseH降解模板后加入T4連接酶。 在加入T4連接酶時(shí)發(fā)生兩種反應(yīng)：環(huán)化反應(yīng)(連接酶將一條cDNA的頭尾相連或是將串聯(lián)體的頭尾相連)和串聯(lián)反應(yīng)(兩條不同的cDNA頭尾相連)。無論是環(huán)化反應(yīng)或是串聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物都可以根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)新引物來補(bǔ)充第二條鏈。 環(huán)狀分子或串聯(lián)分子產(chǎn)生第二條cDNA鏈后，在未知區(qū)域的兩側(cè)設(shè)計(jì)一對引物將未知區(qū)域置換到已知序列中間，進(jìn)行普通PCR。環(huán)形-RACE使用一對基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，提高了PCR擴(kuò)增的特異性。 七、RCA-RACE RCA-RACE是利用ATP依賴性的熱穩(wěn)定連接酶，將一條cDNA末端的5'磷酸基團(tuán)和3'羥基連接，形成單分子環(huán)狀DNA。再使用隨機(jī)引物或基因特異性引物，在具有鏈置換活性的φ29 DNA聚合酶催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 RCA-RACE類似于環(huán)形RACE，但是RCA-RACE在環(huán)化的過程中并不會(huì)產(chǎn)生串聯(lián)結(jié)構(gòu)。 八、T-RACE Targeted(靶向) rapid amplification of cDNA ends (T-RACE)。 |
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