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超困困狗g新蟲 (小有名氣)
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干貨分享 | 質(zhì)粒載體
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載體 在Cohen和Boyer的實(shí)驗(yàn)中，兩種質(zhì)粒都能在E. coli中復(fù)制。因此，這兩種質(zhì)粒都可以作為載體，使重組DNA得以復(fù)制。所有基因克隆實(shí)驗(yàn)都需要這樣的載體，我們稱之為載體（Vector），但典型的基因克隆實(shí)驗(yàn)只涉及一個(gè)載體，以及一個(gè)依賴于載體進(jìn)行復(fù)制的外源DNA片段。外源DNA沒有復(fù)制起點(diǎn)，即DNA復(fù)制開始的地方，因此除非將其放入具有復(fù)制起點(diǎn)的載體中，否則它無法復(fù)制。自20世紀(jì)70年代中期以來，已經(jīng)開發(fā)了許多載體；這些載體分為兩大類：質(zhì)粒（plasmid）和噬菌體（phage）。無論載體的性質(zhì)如何，都必須通過轉(zhuǎn)化將重組DNA引入細(xì)菌細(xì)胞。傳統(tǒng)的做法是將細(xì)胞在濃縮的鈣鹽溶液中孵育，使細(xì)胞膜變得通透，然后將這些通透的細(xì)胞與DNA混合，以使DNA進(jìn)入細(xì)胞。或者，人們可以使用高電壓將DNA壓入細(xì)胞，這個(gè)過程稱為電轉(zhuǎn)化（electroperation）。 質(zhì)粒載體 在克隆時(shí)代的早期，Boyer和他的同事們開發(fā)了一系列非常受歡迎的載體，稱為pBR質(zhì)粒系列。如今，除了pBR質(zhì)粒之外，人們還可以選擇許多其他的質(zhì)�？寺≥d體。一個(gè)有用，但稍顯過時(shí)的質(zhì)粒系列是pUC系列。這些質(zhì)�；趐BR322開發(fā)的，其大約40%的DNA已被刪除。此外，pUC載體具有許多限制酶切割位點(diǎn)，這些位點(diǎn)集中在一個(gè)稱為多克隆位點(diǎn)（MCS）的小區(qū)域內(nèi)。pUC載體含有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因，以允許選擇接收質(zhì)�？截惖募�(xì)菌。此外，它們具有在篩選含有重組DNA的克隆時(shí)提供便利的遺傳元件。 pUC載體的多克隆位點(diǎn)位于編碼β-半乳糖苷酶氨基末端部分（α-肽）的DNA序列（稱為lacZ'）內(nèi)。與pUC載體一起使用的宿主細(xì)菌攜帶編碼β-半乳糖苷酶羧基末端部分（β-肽）的基因片段。僅憑這些部分基因產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶片段沒有活性。但它們可以在體內(nèi)通過所謂的α-互補(bǔ)來互補(bǔ)。換句話說，這兩個(gè)部分基因產(chǎn)物可以結(jié)合形成具有活性的β-半乳糖苷酶。因此，當(dāng)pUC18自身轉(zhuǎn)化攜帶部分β-半乳糖苷酶基因的細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，會(huì)產(chǎn)生活性β-半乳糖苷酶。如果將這些克隆接種在含有β-半乳糖苷酶指示劑的培養(yǎng)基上，含有pUC質(zhì)粒的菌落將變色。例如，指示劑X-gal是一種合成、無色的半乳糖苷；當(dāng)β-半乳糖苷酶分解X-gal時(shí)，它會(huì)釋放出半乳糖和一種可以將細(xì)菌菌落染成藍(lán)色的靛藍(lán)染料。 另一方面，通過將一個(gè)插入片段放入多克隆位點(diǎn)，通常會(huì)中斷質(zhì)粒的部分β-半乳糖苷酶基因。它無法再產(chǎn)生與宿主細(xì)胞的β-半乳糖苷酶片段互補(bǔ)的產(chǎn)物，因此X-gal保持無色。因此，挑選帶有插入片段的克隆很簡(jiǎn)單。它們是白色的；其余的都是藍(lán)色的。注意這是一個(gè)一步的過程。同時(shí)尋找具有以下兩個(gè)特征的克�。海�1）在氨芐青霉素上生長(zhǎng)；（2）在X-gal存在時(shí)呈白色。多克隆位點(diǎn)已經(jīng)精心構(gòu)建，以保持β-半乳糖苷酶的可讀框。因此，即使基因被18個(gè)密碼子中斷，仍然會(huì)產(chǎn)生功能性蛋白。但是，大型插入片段的進(jìn)一步中斷通常會(huì)破壞基因的功能。 即使有顏色篩選，pUC克隆也可能產(chǎn)生假陽性，即沒有插入片段的白色菌落。如果載體的末端在連接到插入片段之前被核酸酶“啃咬”了一點(diǎn)，然后這些稍微降解的載體在連接步驟中簡(jiǎn)單地閉合，那么lacZ’基因可能已經(jīng)改變得足以產(chǎn)生白色菌落。這強(qiáng)調(diào)了使用純DNA和不含核酸酶活性的酶的重要性。 載體自連接的現(xiàn)象在我們使用沒有顏色篩選的載體時(shí)可能成為一個(gè)更大的問題，因?yàn)檫@樣更難以區(qū)分帶有插入片段的菌落和沒有插入片段的菌落。即使在使用pUC和相關(guān)載體時(shí)，我們也希望盡量減少載體自身連接的情況。一個(gè)好的方法是使用堿性磷酸酶處理載體，這會(huì)去除連接所需的5’-磷酸基團(tuán)。沒有這些磷酸基團(tuán)，載體就無法自身連接，但仍可以與保留其5’-磷酸基團(tuán)的插入片段連接。上圖說明了這個(gè)過程。請(qǐng)注意，由于只有插入片段具有磷酸基團(tuán)，連接產(chǎn)物中會(huì)留下兩個(gè)缺口（未形成的磷酸二酯鍵）。這些缺口不是問題；一旦連接的DNA進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，它們將被DNA連接酶在體內(nèi)封閉。多克隆位點(diǎn)還允許使用兩種不同的限制酶（例如EcoRI和BamHI）對(duì)其進(jìn)行切割，然后克隆一個(gè)具有一個(gè)EcoRI末端和一個(gè)BamHI末端的DNA片段。這稱為定向克隆，因?yàn)椴迦氲腄NA只能以一個(gè)方向放入載體中。（插入的EcoRI和BamHI末端必須與載體中的對(duì)應(yīng)末端匹配。）知道插入片段的方向具有某些好處，我們將在本章后面探討這些好處。定向克隆還具有防止載體簡(jiǎn)單地自身重新連接的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槠鋬蓚�(gè)限制酶切割位點(diǎn)是不兼容的�，F(xiàn)在有比這些更方便的載體可用。 總結(jié) 第一代質(zhì)�？寺≥d體包括pBR322和pUC質(zhì)粒。后者具有氨芐青霉素抗性基因和一個(gè)中斷部分β-半乳糖苷酶基因的多克隆位點(diǎn)。通過篩選對(duì)氨芐青霉素有抗性的克隆，這些克隆不產(chǎn)生活性β-半乳糖苷酶，因此不會(huì)使指示劑X-gal變藍(lán)。多克隆位點(diǎn)還使得進(jìn)行定向克隆到兩個(gè)不同的限制酶切割位點(diǎn)變得方便。 |
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