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實驗技巧 | Western Blot實戰(zhàn)經驗匯總
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1、轉膜不充分 (1)膜沒有完全均勻濕透 使用100% methanol浸透膜。 (2)靶蛋白分子量小于10 000 選擇小孔徑的膜，縮短轉移時間。 (3)靶蛋白等電點等于或接近轉移緩沖液pH值 可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液（pH 10.5)或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液。 (4)甲醇濃度過高 過高甲醇濃度會導致蛋白質與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時會使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替。 (5)轉移時間不夠 對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉移時間。 2、背景高 (1)膜沒有完全均勻濕透 使用100% methanol浸透膜。 (2)洗膜不充分 增加洗液體積和洗滌次數。 (3)阻斷不充分 增加封閉液孵育時間，或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑（脫脂奶粉，BSA，酪蛋白等）。 (3)二抗?jié)舛冗^高 降低二抗?jié)舛取?br /> (4)檢測過程中膜干燥 保證充分的反應液，避免出現干膜現象。 (5)曝光過度 縮短曝光時間。 (6)抗體與阻斷蛋白有交叉反應 檢測抗體與阻斷蛋白的交叉反應性，選擇無交叉反應的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應。 3、沒有陽性條帶 （1）抗體染色不充分 增加抗體濃度，延長孵育時間。 （2）酶失活 直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物。 （3）標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 設置陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。 （4）試劑不匹配 一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間不匹配。通過設置內參照可以驗證二級檢測系統(tǒng)的有效性。 （5）一抗失效 選擇在有效期內抗體；并選擇現配現用的工作液。 （6）HRP抑制劑 所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉。 4、有陽性條帶，但條帶比較弱 （1）抗體染色不充分 增加抗體濃度，延長孵育時間。 （2）酶活性降低 直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物。 （3）標本中靶蛋白含量太低 增加標本上樣量。 （4）洗膜過度 縮短洗滌時間。 （5）HRP抑制劑 所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉。 （6）抗體活性降低 選擇在有效期內的抗體，工作液現配現用，避免長時間放置。 （7）封閉過度 減少封閉劑的量或縮短時間；換用不同封閉劑類型。 （8）曝光時間過短 延長曝光時間。 （9）HRP抑制劑 所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉。 5、條帶位置（大小）不對；或有非特異性條帶 （1）二抗的非特異性結合 增加一個對照：不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否由二抗系統(tǒng)來源。選擇其他二抗（特異性更強的，只針對重鏈的）。 （2）一抗的特異性不夠 使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性。 （3）蛋白降解 使用新鮮制備的標本，并使用蛋白酶抑制劑。 （4）二聚體或多聚體存在 增加蛋白質變性過程及強度。 （5）抗體濃度過高 降低抗體（一抗、二抗）濃度，可以減少非特異性條帶。 （6）蛋白上樣量過大 降低上樣量。 6、背景有斑點 （1）封閉劑中有聚集體 使用前過濾封閉試劑。 （2）HRP耦聯二抗中有聚集體 過濾二抗試劑，去除聚集體。 7、膜上出現反像（暗背景上白色帶） （1）HRP含量過高 降低酶聯二抗的濃度。 |
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 實驗 |
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