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科研實驗_研實新蟲 (小有名氣)
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[交流]
關(guān)于質(zhì)粒提取的那些事兒
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雖然質(zhì)粒提取是非常簡單的操作，但是很多人對于其中的原理并非清楚。只知道在使用試劑盒的時候，加入溶液1，2，3，不知道溶液中含有的具體成分，也不清楚，每一種成分所起到的作用。 細(xì)胞中存在蛋白質(zhì)，chromsomal DNA，plasmid DNA，RNA，我們的目的是把質(zhì)粒DNA給提取出來，而且不能摻雜其他的生物大分子。蛋白質(zhì)可以讓它沉淀，RNA可以加入RNase降解，可以看出，質(zhì)粒提取最關(guān)鍵的問題是如何把chromosomal DNA和plasmid DNA給區(qū)分開來。 細(xì)菌沒有細(xì)胞核，只有一個擬核（nucleoid），chromosomal DNA是環(huán)狀的，但是并非裸露的，上面結(jié)合有多種NAPs(nucleoid-associated proteins)。NAPs和基因轉(zhuǎn)錄活性可以改變擬核的形態(tài)結(jié)構(gòu)。相對之下，plasmid DNA就要簡單很多，游離于細(xì)胞質(zhì)中，以共價閉環(huán)cccDNA（convalently closed circular DNA ）的形態(tài)存在。 圖片 圖1 細(xì)菌擬核相關(guān)結(jié)構(gòu) 質(zhì)粒提取主要包括三個步驟：菌體擴繁、菌體裂解釋放質(zhì)粒DNA，和質(zhì)粒DNA的分離與純化。質(zhì)粒提取主要有堿裂解法，煮沸裂解法，小量一步提取法等。 質(zhì)粒提取方法中，最常用的是堿裂解法，它具有得率高，適用面廣，快速，純度高等特色。堿裂解法是根據(jù)共價閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)差異來分離的。其原理是：在強堿環(huán)境（pH12.0-12.6）下，細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被SDS破壞，基因組DNA和質(zhì)粒DNA被釋放出來，宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)、染色體及線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞而發(fā)生變性（質(zhì)粒DNA因為其分子量小而纏結(jié)嚴(yán)密不易變性）。雖然在強堿的條件下共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會發(fā)生變性，但兩條互補鏈仍會互相盤繞，并緊密的結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8的乙醋酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復(fù)中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復(fù)性快（可恢復(fù)天然構(gòu)象），而線性的染色體DNA復(fù)性緩慢，細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復(fù)合物，后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當(dāng)用鉀離子取代鈉離子時，復(fù)合物會從溶液中有效地沉淀下來，離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA（在高鹽條件下，細(xì)胞碎片、變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA發(fā)生沉積，離心后可去除。上清中的質(zhì)粒DNA可經(jīng)過乙醇沉積或許硅膠膜特異性吸附等方法，將質(zhì)粒DNA從上清中回收）。 總結(jié)來說，堿裂解法主要使用三種溶液（根據(jù)1979年J.Doly發(fā)表文章A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA,也就是經(jīng)常說的堿裂解法)。The principle of alkaline extraction就是選擇性地讓chromosomal DNA發(fā)生變性，而plasmid DNA不會發(fā)生變性，仍然以雙鏈形式存在。 在溶液Ⅰ中：Lysozyme可以溶解細(xì)胞壁，對于一些細(xì)胞壁比較厚的細(xì)菌，加入Lysozyme，是不錯的選擇，但是我們?nèi)粘Ｌ崛≠|(zhì)粒的試劑盒似乎在溶液Ⅰ中沒有添加Lysozyme。EDTA或者CDTA是金屬離子螯合劑，能夠螯合Ca2+、Mg2+等二價金屬離子。大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，細(xì)胞壁最外層是脂多糖LPS，攜帶負(fù)電荷。要維系LPS的穩(wěn)定性，必須要有足夠多的Ca2+。如果用EDTA螯合掉Ca2+，就會使LPS解體，暴露出內(nèi)層的肽聚糖，因而容易被Lysozyme水解。Ca2+、Mg2+也是細(xì)胞膜的重要成分，同時，對于細(xì)胞內(nèi)很多酶的活性至關(guān)重要。EDTA可以破壞細(xì)胞膜，抑制細(xì)胞內(nèi)許多酶的活性，比如核酸酶，防止DNA被降解掉。Glucose可以給細(xì)胞一個osmotic shock(滲透壓)，導(dǎo)致細(xì)胞壁和細(xì)胞膜裂解，還有一種說法，Glucose可以增加溶液的黏稠度。使細(xì)胞不至于快速沉降。J.Doly文章只提到一句，用Glucose可以更精確控制溶液PH，不太明白其中的原理。 在溶液Ⅱ中：SDS能夠破壞細(xì)胞壁，讓細(xì)胞內(nèi)容物(Lysate)釋放出來，還可以使蛋白變性，性，結(jié)合到蛋白質(zhì)表面。在這個過程中，chromosomal DNA會被降解成線性片段，一旦遇到強堿（12.0-12.5），chromosomal DNA會發(fā)生變性分離變成單鏈，但是plasmid DNA對此PH范圍耐受，仍然以雙鏈形式存在。 在溶液Ⅲ中：加入醋酸鈉可以中和強堿，chromosomal DNA發(fā)生復(fù)性，但是無法恢復(fù)原來天然的雙鏈結(jié)構(gòu)，而是形成一團纏繞在一起無法溶解的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。高濃度的鈉鹽溶液可以讓SDS-protein-chromosomal DNA復(fù)合物沉淀析出。接來下通過高速離心，SDS-protein-chromosomal DNA復(fù)合物，其他的細(xì)胞裂解物全部沉淀管底，只有plasmid DNA溶解在上清中。 大，小和中提的區(qū)別和應(yīng)用 質(zhì)粒抽提按得到質(zhì)粒DNA的量可分為小提，中提，大提。 質(zhì)粒小提用的菌液量很少，一般1-5ml，提出的質(zhì)粒DNA量較少，其特點是簡便、快速，能同時處理大量試樣，所得DNA有一定純度，此質(zhì)粒DNA可直接用于DNA序列分析，各種酶促反應(yīng)，PCR以及部分細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染等對質(zhì)粒濃度要求不高的實驗。維真生物采用高通量小提試劑盒，從1ml菌液中提取質(zhì)粒，用90ul洗脫液洗脫得到的質(zhì)粒濃度為100-200ng/ul，可以滿足大部分實驗要求，也可以直接用于一般的腺病毒包裝，不過維真生物慢病毒、腺相關(guān)病毒（AAV）包裝一般使用大提試劑盒進行抽提，以保證高滴度及穩(wěn)定的質(zhì)量。 質(zhì)粒中提得到的質(zhì)粒DNA的量介于小提跟大提之間，一般用30-50ml菌液提取，提取的質(zhì)�？捎糜诎盖�、PCR、測序、連接、轉(zhuǎn)化、文庫篩選、體外翻譯、轉(zhuǎn)染一些常規(guī)的傳代細(xì)胞等。從50ml菌液中提取質(zhì)粒可到到500ul質(zhì)粒濃度為0.7-1ug/ul的質(zhì)粒。 質(zhì)粒大提是質(zhì)粒大量提取的簡稱，有些實驗室稱之為大抽。質(zhì)粒大提用于大量菌液的提取，100ml-500ml 均可，大規(guī)模地從細(xì)菌中將擴增的質(zhì)粒提取出來。一般的大提質(zhì)粒試劑盒都是使用純化柱，提取出來的質(zhì)粒純度高，雜質(zhì)少，無內(nèi)毒素，一般用于細(xì)胞的轉(zhuǎn)染等對質(zhì)粒純度高的實驗。從200ml菌液中提取質(zhì)粒，1000ul洗脫液洗脫后得到的質(zhì)粒濃度為0.5-2ug/ul。維真生物慢病毒、腺相關(guān)病毒（AAV）包裝一般使用大提試劑盒進行抽提，以保證高滴度及穩(wěn)定的質(zhì)量。 注：在一個細(xì)菌細(xì)胞中只有5個以下的相同質(zhì)粒時，該質(zhì)粒是低拷貝質(zhì)粒；當(dāng)在一個細(xì)菌細(xì)胞中可以有幾百個相同質(zhì)粒時則該質(zhì)粒是高拷貝質(zhì)粒。低拷貝質(zhì)粒在等量的菌體中的數(shù)量遠(yuǎn)低于高拷貝質(zhì)粒，因此用等量菌體提取質(zhì)粒時，提取的低拷貝質(zhì)粒的濃度會很低。維真生物的過表達(dá)載體是低拷貝質(zhì)粒，對于此類質(zhì)粒載體，若需要大量質(zhì)�；蛘咝√豳|(zhì)粒的實驗效果不好時，則需要加大提取的菌體量，可進行質(zhì)粒中提或者大提，另外，使用去內(nèi)毒素的試劑盒抽提質(zhì)粒時，也會降低最終得到質(zhì)粒的濃度。 注：感受態(tài)菌株是模式菌株，沒有質(zhì)粒，是為了擴增目的質(zhì)粒而生的，否則再轉(zhuǎn)化進目的質(zhì)粒后就會混合了。 質(zhì)粒提取試劑盒選擇 1、小提質(zhì)粒：（特點）簡單快速，可高通量提取 ；（濃度）100-200ng/ul；（用途）測序，PCR，腺病毒包裝、多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗 2、中提質(zhì)粒：（特點）質(zhì)粒DNA量較高，（濃度）0.7-1ug/ul；（用途）測序，多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗 3、大提質(zhì)粒：（特點）質(zhì)粒DNA量非常高，雜質(zhì)少，無內(nèi)毒素（濃度）0.5-2ug/ul （用途）慢病毒、腺相關(guān)病毒包裝，多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染或其他需要大量質(zhì)粒的實驗。 大多數(shù)試劑盒都是在堿裂解法的基礎(chǔ)上優(yōu)化改進的。 對于小量制備的質(zhì)粒DNA， 經(jīng)過苯酚、氯仿抽提，RNA 酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA，所得純化的質(zhì)粒DNA 已可滿足細(xì)菌轉(zhuǎn)化、DNA 片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標(biāo)記等要求，故在分子生物學(xué)實驗室中常用。 分享一種提取質(zhì)粒的方法 試劑準(zhǔn)備： 1. 溶液Ⅰ: 50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O 至500ml。在10 lbf/in2 高壓滅菌15min ，貯存于4℃。 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O 至10ml。使用前臨時配置。 3. 溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O 至500ml。4℃保存?zhèn)溆谩?br /> 4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O 至100ml。15 lbf/in2 高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?br /> 5. 苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1） 6. 乙醇（無水乙醇、70%乙醇） 7. 5×TBE：Tris 堿54g， 硼 酸 27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g， 加 ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2 高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?br /> 8. 溴化乙錠（EB）：10mg/ml 9. RNase A（RNA 酶 A）：不含 DNA 酶(DNase-free) RNase A 的 10mg/ml，TE 配制，沸水加熱15min，分裝后貯存于-20℃。 10. 6×loading buffer（上樣緩沖液）：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青 FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。 11. 1% 瓊脂糖凝膠：稱取1g 瓊脂糖于三角燒瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60℃左右，加 EB 母液（10mg/ml）至終濃度0.5μg/ml（注意：EB為強誘變劑，操作時帶手套），輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min 以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液 0.5×TBE），即可上樣。 操作步驟： 1. 挑取LB 固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于2.0ml LB（含相應(yīng)抗生素）液體培養(yǎng)基中，37℃、250g 振蕩培養(yǎng)過夜（約 12-14hr）。 2. 取1.5ml 培養(yǎng)物入微量離心管中，室溫離心8000g×1min，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。 3. 將細(xì)菌沉淀重懸于100μl 預(yù)冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。 4. 加 200μl 新鮮配制的溶液Ⅱ，顛倒數(shù)次混勻（不要劇烈振蕩），并將離心管放置于冰上2-3min，使細(xì)胞膜裂解（溶液Ⅱ為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。 5. 加入150μl 預(yù)冷的溶液Ⅲ，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ為中和溶液，此時質(zhì)粒 DNA 復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀。 6. 加入450μl 的苯酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，4℃離心 12000g × 10min。 7. 小心移出上清于一新微量離心管中，加入2.5 倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻， 室溫放置 2-5min，4℃離心 12000g×15min。 8. 1ml 預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀1-2 次，4℃離心 8000g×7min，棄上清，將沉淀在室溫下晾干。 9. 沉淀溶于 20μl TE（含 RNase A 20μg/ml），37℃水浴 30min 以降解 RNA 分子，-20℃保存?zhèn)溆谩?br /> 質(zhì)粒DNA 的電泳檢測： 觀察瓊脂凝膠中DNA 的最簡單方法是利用熒光染料溴化乙錠進行染色。該物質(zhì)含有一個可以嵌入DNA 的堆積堿基之間的一個平面基團，這個基團的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致染料與DNA 結(jié)合并呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離染料溶液有所增加。 DNA 吸收254nm 處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身則在302nm 和366nm 有光吸收。這兩種情況下，被吸收的能量可在可見光譜紅橙區(qū)的590nm 處重新發(fā)射出來。因此，當(dāng)凝膠中含有游離溴化乙錠時即可以檢測到少量的DNA。 取制備的質(zhì)粒DNA 1-2μl，加適當(dāng)loading buffer 混勻上樣,采用1-5V/cm 的電壓，使DNA 分子從負(fù)極向正極移動至合適位置，取出凝膠置紫外燈下檢測， 攝片。 注意事項： 本裂解法小量制備質(zhì)粒DNA 重復(fù)性好，一般無麻煩。若所提取質(zhì)粒DNA 不能被限制性內(nèi)切酶切割，可通過酚/氯仿再次抽提，以清除雜質(zhì)來解決問題。 質(zhì)粒提取常見問題及解決方案 1、菌液較多：可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中。收集的菌體量以能夠充分裂解為佳，菌體過多裂解不充分會降低質(zhì)粒的提取效率。未徹底混勻的菌塊會影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低，菌體懸浮后若有較多的氣泡也會影響裂解，導(dǎo)致導(dǎo)致提取量和純度偏低。質(zhì)粒提取使用的溶液I主要是懸浮菌體，溶液II裂解菌體，其中的高濃度NaOH破會細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使菌體中的質(zhì)粒DNA釋放出來，溶液III主要是中和溶液，使溶液恢復(fù)中性環(huán)境，利于質(zhì)粒DNA復(fù)性，溶液II中SDS的Na+會被K+置換，SDS變?yōu)镻DS并結(jié)合大分子的基因組DNA,蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片形成不溶物，然后通過離心可以得到含有質(zhì)粒DNA的上清。因此加入溶液II后要溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免使基因組DNA斷裂污染質(zhì)粒。所用時間不應(yīng)超過5min，以免質(zhì)粒受到破壞。如果菌液沒有變清亮，可能是由于菌體過多，裂解不徹底，若繼續(xù)進行后續(xù)操作會得到鼻涕狀的沉淀，無法通過離心分離得到含有DNA 的上清液，因此在加入溶液Ⅱ后菌液沒有變清亮后可以適當(dāng)按比例加大溶液Ⅱ和后續(xù)溶液Ⅲ的用量。 2、菌液培養(yǎng)時間：使用TB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌液的時間一般在16小時左右，菌液OD值在2.5-2.6左右為佳，培養(yǎng)時間短會導(dǎo)致菌體生長不充分，培養(yǎng)時間過長菌體會出現(xiàn)死亡，導(dǎo)致活菌比例降低，進而基因組DNA污染概率增大。培養(yǎng)時間應(yīng)優(yōu)選的控制在12-16 h內(nèi)。 3、宿主菌株：宿主菌株的種類將會影響質(zhì)粒的收獲量。含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株，HB101, 如JM101, JM110, TG1以及它們的衍生菌株，通常因為內(nèi)源核酸酶的存在，或者在提取過程中釋放出來的核酸酶的作用下，將會顯著影響最終收獲量，或者純化到的質(zhì)粒容易降解，推薦將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至不含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株中，如Top10, DH5a進行質(zhì)粒純化。 4、質(zhì)�？截悢�(shù)低：由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體，或者加大提取的菌液量，并減小洗脫時的體積。當(dāng)所提取的質(zhì)粒大于10 kb時，由于菌體承載力有限，大質(zhì)粒復(fù)制效率往往會低于普通質(zhì)粒，因此推薦增大菌液量以獲得更好的提取產(chǎn)量。 5、菌體中無質(zhì)粒：有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長期保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時應(yīng)接種單菌落。有時菌種保存一段時間后會出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的情況，導(dǎo)致無法提出質(zhì)粒，若有保存的質(zhì)�？梢赞D(zhuǎn)化后再挑取單克隆搖菌提質(zhì)粒。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。 6、堿裂解不充分：使用過多菌體培養(yǎng)液，會導(dǎo)致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加裂解液的用量。并確保細(xì)菌混懸均勻。菌體沉淀未能充分懸浮或懸浮后有較多氣泡也會導(dǎo)致裂解不充分，要注意讓菌體充分懸浮并將較多的氣泡用移液器吸出。對低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時可加大菌體用量并加倍使用試劑盒溶液，可以有助于增加質(zhì)粒提取量和提高質(zhì)粒質(zhì)量。 7、溶液使用不當(dāng)：溶液II在溫度較低時可能出現(xiàn)渾濁，可置于42℃水浴保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，方可使用。 8、吸附柱過載：不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB或2×YT，菌液體積必須減少;若質(zhì)粒是非常高的拷貝數(shù)或宿主菌具有很高的生長率，則需減少LB培養(yǎng)液體積。 9、質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時) ：洗脫溶解質(zhì)粒時，可適當(dāng)加溫或延長溶解時間。 10、乙醇?xì)埩簦浩匆合礈旌髴?yīng)離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實驗。為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響，可置于室溫靜置20-30分鐘，或放到超凈臺上風(fēng)吹15分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。 11、鹽離子污染：當(dāng)漂洗操作不當(dāng)或漂洗不充分時將導(dǎo)致鹽離子污染，該指標(biāo)可通過OD260/230比值鑒定，通常大于2.0是可接受的。在使用試劑盒時應(yīng)確保Wash Buffer的漂洗次數(shù)和漂洗液加入量。 11、洗脫液加入位置不正確：洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到最大洗脫效率。若第一次沒有將洗脫液準(zhǔn)確加到硅膠膜的中心部位，可以離心后將離心下來的洗脫液按正確方式重新上柱再次洗脫。 12、洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH 7.0-8.5間。當(dāng)用水洗脫時確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。為追求高濃度質(zhì)粒而減小洗脫液體積將會導(dǎo)致洗脫不充分進而降低產(chǎn)量，因此要確保洗脫液的用量，此外Elution Buffer預(yù)熱至60℃和重復(fù)洗脫將更有利于洗脫效率提升。 13、洗脫體積太�。合疵擉w積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。 14、洗脫時間過短：洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時在說明書的建議時間基礎(chǔ)上適當(dāng)延長靜置或者洗脫兩次可達(dá)到較好的效果。 |
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[考研] 0703化學(xué)306調(diào)劑 +4 | 26要上岸 2026-03-03 | 4/200 |
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[基金申請] 沒有青基直接申請面上，感覺自己瘋了 +5 | kevin63t 2026-03-02 | 6/300 |
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[考研] 085602化學(xué)工程350，調(diào)劑，有沒有211的 +5 | 利好利好. 2026-03-02 | 9/450 |
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[考研] 289求調(diào)劑 +7 | BrightLL 2026-03-02 | 9/450 |
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[考研] 283求調(diào)劑 +9 | 鹿沫笙 2026-03-02 | 9/450 |
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[考研] 一志愿中科大能動297求調(diào)劑，本科川大 +3 | 邵11 2026-03-03 | 3/150 |
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[考研] 284求調(diào)劑 +6 | 天下熯 2026-03-02 | 6/300 |
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[考研] 268求調(diào)劑 +6 | 好運連綿不絕 2026-03-02 | 6/300 |
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[考研] 26考研報考西工大材料308分求調(diào)劑 +4 | weizhong123 2026-03-01 | 5/250 |
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[考研] 沒上岸的看過來 +3 | tangxiaotian 2026-03-01 | 3/150 |
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[考研] 292求調(diào)劑 +7 | yhk_819 2026-02-28 | 7/350 |
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[考研] 264求調(diào)劑 +4 | 巴拉巴拉根556 2026-02-28 | 4/200 |
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[考研] 274求調(diào)劑 +3 | cgyzqwn 2026-03-01 | 7/350 |
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[考研] 279求調(diào)劑 +3 | dua1 2026-03-01 | 4/200 |
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[基金申請]
本子寫完了，給DS兄弟看了，得了92分
+3
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Doma 2026-03-01 | 7/350 |
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[考研] 272求調(diào)劑 +6 | 田智友 2026-02-28 | 6/300 |
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