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超困困狗g新蟲 (小有名氣)
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[交流]
原核蛋白表達(dá)的整體實(shí)驗(yàn)流程和具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果
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一、假設(shè)目標(biāo)蛋白的信息 名稱： XXX蛋白 大�。� 30 kDa 緩沖液：PBS 濃度： 0.6mg/mL 體積： 6mL （3管分裝） 標(biāo)簽: 僅6Xhis 純度： 90%以上 二、實(shí)驗(yàn)過程 1蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建 1.1 序列二基因序列密碼子優(yōu)化后合成及構(gòu)建 Optimized for your reference: CATATGxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxCTCGAG 合成時(shí)候帶上上下游酶切位點(diǎn)分別是Nde I，Xho I（黃色陰影），并克隆到原核表達(dá)載體Pet24a載體。 1.2 DNA測(cè)序 將經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性克隆測(cè)序，測(cè)序工作由華大基因完成（見附件）。 2 構(gòu)建正確的Pet24a-序列二表達(dá)載體在大腸桿菌中的表達(dá) 2.1 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3) 常規(guī)CaCl2法。 2.2 IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá) 2.2.1 挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆接種于含50 μg/ml Kan的3 ml LB培養(yǎng)液的試管中，37℃ 220 rpm振搖過夜； 2.2.2 次日按1：100接種于50 μg/ml Kan的30 ml LB培養(yǎng)液中，37℃ 220 rpm振搖至菌體OD600為0.4 (約2h)； 2.2.3 取出1 ml培養(yǎng)物，12000g室溫離心2 min，棄上清，用100 μl 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀； 2.2.4 向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/l，37℃ 220 rpm振搖4 h，誘導(dǎo)序列二蛋白表達(dá)； 2.2.5取出1 ml培養(yǎng)物，12000g室溫離心2 min，棄上清，用100 μl 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀，剩余培養(yǎng)物4℃ 4000g離心12 min，棄上清，沉淀置-20℃凍存。 2.3 表達(dá)產(chǎn)物分布的確定 2.3.1 將表達(dá)菌體重懸于400 μl Ni-IDA Binding-Buffer(20 mM Tris-HCl，5 mM咪唑，0.5 M NaCl，pH8.0)； 2.3.2 重懸液進(jìn)行超聲波破碎(冰浴中進(jìn)行)：功率100 W，工作4 sec，間歇8 sec，共10 min； 2.3.3 超聲破碎液4℃ 12000g離心20 min，取10 μl上清液加入等量的2×上樣緩沖液，沉淀用400 μl 1×上樣緩沖液重懸后取5 μl，恒壓150 V進(jìn)行12% SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)R250染色顯帶。 3融合蛋白的純化 3.1 將1 L誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)菌體沉淀用20 ml Ni-IDA Binding-Buffer重懸后，超聲破碎(功率200 W，工作4 sec，間歇8 sec，共20 min)，4℃ 12000g離心20 min，取上清； 3.2 利用Biologic LP層析系統(tǒng)，上清液以0.5 ml/min流速上樣至Ni-IDA Binding-Buffer預(yù)平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B親和層析柱； 3.3 用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 ml/min流速?zèng)_洗，至流出液OD280值到達(dá)基線； 3.4 用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mM Tris-HCl，30 mM咪唑，0.5 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速?zèng)_洗，至流出液OD280值到達(dá)基線； 3.5 用Ni-IDA Elution-Buffer(20 mM Tris-HCl，250 mM咪唑，0.5 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速洗脫目的蛋白，收集流出液； 3.6 進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 圖片 SDS-PAGE結(jié)合考染鑒定純化的XXX蛋白 1-4泳道分別指XXX蛋白放大表達(dá)后的全菌、破碎上清、純化時(shí)20mM咪唑洗脫液以及250mM咪唑洗脫液。 |
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