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科研戰(zhàn)神·王鐵蟲 (小有名氣)
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5分鐘學(xué)會(huì)如何設(shè)計(jì)PCR引物
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查找目的基因序列并不能直接用于我們研究所用，因?yàn)椴檎业降幕蛐蛄兄荒芩闶腔虻碾娮有蛄校⒉皇俏覀冄芯恳玫默F(xiàn)實(shí)中的序列，如何獲得現(xiàn)實(shí)的基因序列呢？這就需要我們根據(jù)基因的電子序列來設(shè)計(jì)引物了，通過引物借助PCR方法才能獲得我們的目的基因序列。接下來，我們將介紹一下PCR方法并講述如何設(shè)計(jì)引物。 PCR（polymerasechainreaction），即聚合酶鏈反應(yīng)，又稱基因體外擴(kuò)增技術(shù)，是由一對(duì)引物介導(dǎo)、能在體外對(duì)特定DNA片段進(jìn)行快速酶促擴(kuò)增的技術(shù)。PCR能把很微量的遺傳物質(zhì)在數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍達(dá)到檢測(cè)水平．使原來無法進(jìn)行分析和檢測(cè)的許多項(xiàng)目得以完成。PCR引物設(shè)計(jì)的目的是找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。對(duì)引物的設(shè)計(jì)不可能有一種包羅萬(wàn)象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計(jì)。 1、 引物的特異性 引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。 2、 避開產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū) 某些引物無效的主要原因是引物重復(fù)區(qū)DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測(cè)估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。 3、 長(zhǎng)度 寡核苷酸引物長(zhǎng)度為15~30bp，一般為20~27mer。引物的有效長(zhǎng)度：Ln=2（G+C）+（A+T）Ln值不能大于38，因?yàn)?gt;38時(shí)，最適延伸溫度會(huì)超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74℃),不能保證產(chǎn)物的特異性。 4、 G+C含量 G+C含量一般為40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。 5、 堿基隨機(jī)分布 引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。 6、 引物自身 引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。 7、 引物之間 兩引物之間不應(yīng)有互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3′端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。 8、 引物的3′端 引物的延伸是從3′端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反應(yīng)中，引物3′端不能發(fā)生錯(cuò)配。在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中，用2UTaqDNA聚合酶和800μmol/LdNTP（四種dNTP各200μmol/L）以質(zhì)粒（103拷貝）為模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增HIV-1gag基因區(qū)的條件下，引物3′端錯(cuò)配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。A∶A錯(cuò)配使產(chǎn)量下降至1/20，A∶G和C∶C錯(cuò)七下降至1/100。引物A：模板G與引物G：模板A錯(cuò)配對(duì)PCR影響是等同的。 9、 引物的5′端 引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。 10、 密碼子的簡(jiǎn)并 如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。 舉例：Primer5.0設(shè)計(jì)引物舉例 圖片 打開程序首先進(jìn)入的是序列編輯參看，與Plasmid Premier 相比，其多了一個(gè)語(yǔ)音校正的功能，即在輸入序列的時(shí)候，程序自動(dòng)將堿基讀出，以便用戶進(jìn)行校正，保證輸入的正確和快速。 點(diǎn)擊該界面的按鈕即可進(jìn)入到程序的引物設(shè)計(jì)窗口。 圖片 該界面共分為四層，最上面一層左面是5 個(gè)控制按鈕，用于實(shí)現(xiàn)引物設(shè)計(jì)中的各種功能，包括引物自動(dòng)尋找，尋找結(jié)果查看和引物編輯；右邊是觀察兩個(gè)引物在模板上結(jié)合位置的直觀圖以及對(duì)正鏈還是負(fù)鏈引物進(jìn)行選擇；第二層是顯示模板和引物序列及二者間的配對(duì)情況的顯示；第三層是顯示兩個(gè)引物的各種參數(shù)，包括給引物的打分，引物以及產(chǎn)物的起始位置、長(zhǎng)度、Tm 值、GC％消光系數(shù)、簡(jiǎn)并性；最后一層是給出的有關(guān)于引物的二聚體結(jié)構(gòu)、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、錯(cuò)配情況和引物間二聚體結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，左邊是顯示是否存在以上各種對(duì)PCR 擴(kuò)增有影響的結(jié)構(gòu)，右邊顯示的是這些結(jié)構(gòu)的位置，結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)和穩(wěn)定能，利用這些參數(shù)可以對(duì)引物作出可靠的評(píng)價(jià)。 圖片 下面是根據(jù)模板序列尋找引物的界面，在該界面中可以設(shè)定所要搜索的引物的類型，包括PCR 引物，測(cè)序引物和雜交探針以及引物所在的鏈；另外也能設(shè)定搜索引物的范圍，以及最終PCR 產(chǎn)物的長(zhǎng)度和引物的長(zhǎng)度等。 圖片 并通過來點(diǎn)擊按鈕來設(shè)置一些搜尋參數(shù)： 這些參數(shù)包括引物的Tm 值，GC 比，有簡(jiǎn)并性堿基，3’端穩(wěn)定性，引物的穩(wěn)定性，重復(fù)序列，二聚體/發(fā)卡結(jié)構(gòu)和與模板及可能的雜質(zhì)DNA（需要從另外的序列文件中讀入）之間的錯(cuò)配情況，這些參數(shù)的設(shè)定可以根據(jù)要求變化，程序本身根據(jù)一定的標(biāo)準(zhǔn)分成從極高嚴(yán)謹(jǐn)性到極低嚴(yán)謹(jǐn)性5 個(gè)檔次。該程序?qū)σ锏淖詣?dòng)搜索過程是采用的排除法，根據(jù)用戶設(shè)定的引物范圍和產(chǎn)物長(zhǎng)度所規(guī)定區(qū)域內(nèi)，所有的符合設(shè)定的引物長(zhǎng)度的寡核苷酸都被視為可能的引物，然后根據(jù)以上各個(gè)參數(shù)逐步去除不符合條件的寡核苷酸，經(jīng)過這種層層剔除的篩選，最終找到符合用戶所設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)的引物，如果找不到合適的引物可以逐步降低要求來進(jìn)行進(jìn)一步搜尋。 搜尋到引物結(jié)果最終顯示在下面的窗口中： 圖片 在結(jié)果窗口中給出了程序給該對(duì)引物的打分（rating）和上下游引物的起始位置和長(zhǎng)度以及產(chǎn)物的長(zhǎng)度。通過直接點(diǎn)擊各對(duì)引物在相應(yīng)引物搜尋界面中相應(yīng)的顯示引物的各種信息。包括其各種參數(shù)和各種可能存在的不利結(jié)構(gòu)。 圖片 其中用File 菜單中的Parameter 命令可以對(duì)系統(tǒng)參數(shù)，PCR 反應(yīng)條件和程序打分系統(tǒng)進(jìn)行設(shè)置，以幫助用戶根據(jù)自己的特殊要求來進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，其中反應(yīng)條件按照引物濃度，單價(jià)離子濃度，Mg 離子濃度，Na 鹽濃度等。利用該打分系統(tǒng)可以為對(duì)引物進(jìn)行有效評(píng)估和和在引物之間進(jìn)行對(duì)比選擇提供有效的有效的依據(jù)。 圖片 最后還可以在利用引物編輯窗口對(duì)程序自動(dòng)找到的或手工找到的引物序列進(jìn)行編輯，以便用戶能在引物引入突變及加入特定的酶切位點(diǎn)，并對(duì)修改后的序列的二聚體結(jié)構(gòu)、發(fā)卡結(jié)構(gòu)和錯(cuò)配進(jìn)一步評(píng)估。其中是對(duì)修改后的引物再次搜尋找出其最合適的引發(fā)位置。 除了以上的直觀地對(duì)引物進(jìn)行基本的設(shè)計(jì)和評(píng)估功能外，該程序還提供了多種數(shù)據(jù)報(bào)告，主要通過Report 菜單和Graph 菜單中命令來實(shí)現(xiàn)： 圖片 圖片 |
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