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科研戰(zhàn)神·王鐵蟲 (小有名氣)
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蛋白實(shí)驗(yàn) | 染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）
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早期，人們就發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞的生命活動(dòng)中，DNA復(fù)制、mRNA轉(zhuǎn)錄與修飾以及病毒的感染等，都涉及基因-蛋白質(zhì)相互作用，很多生理學(xué)家都探討了這種現(xiàn)象的發(fā)生過(guò)程。 近年來(lái)，隨著研究的深入，很多醫(yī)學(xué)研究者已經(jīng)將目光投向了基因-蛋白相互作用，期望在此水平上，另辟蹊徑，深入分析癌癥、心血管疾病、中央神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等疾病的主要代謝通路和發(fā)生機(jī)制。 ChIP 是一種在體內(nèi)研究轉(zhuǎn)錄因子和靶基因啟動(dòng)子區(qū)域直接相互作用的方法，可以在體內(nèi)直接確定它們之間相互作用方式的動(dòng)態(tài)變化，能夠得到轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的信息，確定其直接靶基因。它早期多被用于研究核小體上的 DNA 和組蛋白的相互作用以及組蛋白的修飾等方面。近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，ChIP 技術(shù)不斷發(fā)展和完善，被廣泛應(yīng)用于體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與靶基因啟動(dòng)子上特異核苷酸序列結(jié)合方面的研究，并成為在染色質(zhì)水平研究基因表達(dá)調(diào)控的有效方法。 ChIP原理及應(yīng)用方向 通過(guò)甲醛將染色質(zhì)上的DNA和目的蛋白交聯(lián)； 通過(guò)超聲或酶解的方法將染色質(zhì)片段化； 包含有目的蛋白的染色質(zhì)片段通過(guò)抗體富集純化； 通過(guò)加熱解除DNA和目的蛋白的交聯(lián)； 通過(guò)蛋白酶和RNA酶消化去除目的染色質(zhì)的蛋白和RNA之后，將目的DNA純化出來(lái)； 得到的DNA可以通過(guò)PCR檢測(cè)目標(biāo)區(qū)域的DNA是否被目的蛋白富集，或者通過(guò)DNA測(cè)序的方式檢測(cè)目的蛋白在全基因組上的分布； ChIP原理看似簡(jiǎn)單，但要想做好ChIP ，得到高質(zhì)量的數(shù)據(jù)卻絕非易事。 圖片 ChIP的應(yīng)用方向： DNA甲基化 蛋白質(zhì)甲基化 組蛋白修飾 ChIP實(shí)驗(yàn)步驟可分6步： 細(xì)胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎； 細(xì)胞裂解，除雜及抗體哺育； 分出一半用酚/氯仿抽提，電泳檢測(cè)超聲效果； 免疫復(fù)合物的沉淀及清洗； DNA樣品的回收； PCR分析，比較傳統(tǒng)的做法是半定量-PCR。但是現(xiàn)在隨著熒光定量PCR的普及，大家也越來(lái)越傾向于Q-PCR了。 因ChIP試劑盒操作參差不齊，因此實(shí)驗(yàn)的具體步驟不再展開，大家只需要按照手頭上的試劑盒操作說(shuō)明嚴(yán)格操作即可，但是核心步驟基本符合。接下來(lái)的內(nèi)容主要是注意事項(xiàng)。 注意事項(xiàng) 想要做好ChIP實(shí)驗(yàn)，必須要控制好6個(gè)方面，包括培養(yǎng)基內(nèi)活細(xì)胞數(shù)量、交聯(lián)時(shí)間長(zhǎng)短、消化后的片段大小、抗體的種類和特異性、常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)等多種因素影響 。想要控制這些過(guò)程，最核心的就是全面設(shè)置對(duì)照組。下面逐個(gè)做說(shuō)明。 01 活細(xì)胞數(shù)量 圖片 活細(xì)胞計(jì)數(shù)后，如果最終用于ChIP實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)量太高，將直接導(dǎo)致甲醛交聯(lián)時(shí)間增加，間接導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量/微球菌核酸酶比例增大，這些均可造成裂解的DNA小片段過(guò)長(zhǎng)（超過(guò)1000bp），實(shí)驗(yàn)處理過(guò)程中極易丟失這些片段，最終也會(huì)造成PCR檢測(cè)困難或失敗。最佳的DNA片段長(zhǎng)度是150bp-300bp。相反，如果細(xì)胞數(shù)量太少，則導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量/微球菌核酸酶比例減小，最終得到的DNA片段極可能小于100bp。 總之，DNA-蛋白豐度直接決定了ChIP實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞數(shù)量，沒(méi)有固定的數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)，這些都需要預(yù)實(shí)驗(yàn)充分摸索。 02 甲醛交聯(lián)時(shí)間 1%終濃度的甲醛交聯(lián)時(shí)間推薦5-6分鐘。時(shí)間過(guò)久，會(huì)造成裂解的DNA小片段過(guò)長(zhǎng)（超過(guò)1000bp）。時(shí)間太短，會(huì)導(dǎo)致交聯(lián)不完全，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中導(dǎo)致一部分的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物分離，最終分析的結(jié)果必然是不準(zhǔn)確的。 03 設(shè)置對(duì)照組 ChIP實(shí)驗(yàn)內(nèi)對(duì)照：染色質(zhì)斷裂后，須按一定比例留取部分染色質(zhì)溶液，此Input DNA（斷裂后的基因組DNA）作為ChIP實(shí)驗(yàn)的內(nèi)對(duì)照。內(nèi)對(duì)照不僅可以驗(yàn)證染色質(zhì)斷裂的效果。如果按照取樣比例換算，還可以根據(jù)Input DNA中靶序列的含量和染色質(zhì)沉淀中的靶序列含量，推算ChIP實(shí)驗(yàn)效率，所以Input內(nèi)對(duì)照是必須要設(shè)置的。 陽(yáng)性抗體對(duì)照：目的抗體沉淀DNA-蛋白復(fù)合物時(shí)，必須需設(shè)置陽(yáng)性抗體對(duì)照組。陽(yáng)性抗體通常選擇與已知序列相結(jié)合的、各物種之間比較保守的蛋白抗體，常用組蛋白抗體。 抗體陰性對(duì)照：目的抗體沉淀蛋白DNA復(fù)合物時(shí)，必須需設(shè)置陰性抗體對(duì)照組。陰性對(duì)照所使用的抗體可以選擇目的蛋白抗體宿主的血清蛋白。 04 目標(biāo)蛋白抗體 ChIP實(shí)驗(yàn)中與一般的抗原-抗體免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn)不太一樣。 常規(guī)實(shí)驗(yàn)如western blot、蛋白質(zhì)免疫共沉淀等，抗原上只要存在與抗體結(jié)合的位點(diǎn)，則二者的免疫反應(yīng)基本不受到蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)影響。 ChIP實(shí)驗(yàn)中，染色質(zhì)沉淀步驟時(shí)，蛋白和DNA處在交聯(lián)狀態(tài)，目標(biāo)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)形成空間阻礙，導(dǎo)致抗體無(wú)法與目標(biāo)蛋白結(jié)合形成復(fù)合物。 因此，能力夠做western blot、蛋白質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的抗體不一定能夠做ChIP實(shí)驗(yàn)，一定一定要使用已經(jīng)過(guò)ChIP驗(yàn)證的抗體，否則實(shí)驗(yàn)必然失敗。此外，抗體的濃度、孵育時(shí)間、孵育溫度需要根據(jù)目標(biāo)蛋白的豐度決定。目標(biāo)蛋白豐度較低時(shí)，可能需要調(diào)整活細(xì)胞數(shù)量、過(guò)夜4℃孵育等。 圖片 05常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作 ChIP實(shí)驗(yàn)過(guò)程較長(zhǎng)，過(guò)程繁瑣，需要反復(fù)的洗柱、離心、吸液、換管、孵育、震蕩。操作說(shuō)起來(lái)很簡(jiǎn)單，但是每一步都需要小心操作，非�？简�(yàn)基本功，希望大家多多注意。 06 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 對(duì)于Input DNA組，采用1.8%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果應(yīng)該是片段集中于150bp到350bp之間，這樣長(zhǎng)度的DNA片段才是符合要求的。如下： 圖片 進(jìn)一步，內(nèi)對(duì)照組、陰性抗體對(duì)照組、陽(yáng)性抗體對(duì)照組的純化DNA先采用PCR擴(kuò)增，隨后通過(guò)1.8%瓊脂糖凝膠電泳，得到的結(jié)果應(yīng)該是這樣的：空白對(duì)照組無(wú)條帶、陰性抗體對(duì)照組條帶弱或無(wú)、內(nèi)對(duì)照組強(qiáng)條帶、陽(yáng)性對(duì)照組看到強(qiáng)條帶。只有這樣的結(jié)果才是成功的。后續(xù)才能進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。 |
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