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科研顧問(wèn)_Gu新蟲 (小有名氣)
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干貨分享 | 此FISH非彼FISH，這是熒光原位雜交技術(shù)
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一．FISH的定義 熒光原位雜交技術(shù)（FISH）是一種利用熒光信號(hào)檢測(cè)探針的原位雜交技術(shù)[1]。它將熒光信號(hào)的高靈敏度、安全性及直觀性和原位雜交的高特異性結(jié)合起來(lái)，通過(guò)熒光標(biāo)記的核酸探針與待測(cè)樣本核酸進(jìn)行原位雜交。在熒光顯微鏡下對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行辨別和計(jì)數(shù)，從而對(duì)染色體或基因異常的細(xì)胞和組織樣本進(jìn)行檢測(cè)和診斷，為各種基因相關(guān)疾病的分型、預(yù)前和預(yù)后提供準(zhǔn)確的依據(jù)。FISH染色結(jié)果如圖1.1所示。 二．FISH的原理 FISH分為直接法和間接法。 直接法是在已知堿基序列的核酸探針上標(biāo)記熒光素，在組織切片、間期細(xì)胞及染色體標(biāo)本上與靶核酸進(jìn)行原位雜交。因所形成的雜交體帶有熒光素。故可在熒光顯微鏡下直接觀察。 間接法使用非熒光物質(zhì)標(biāo)記的核酸探針。如生物素或地高辛等標(biāo)記探針，再通過(guò)親和連接或免疫反應(yīng)帶入熒光物質(zhì)來(lái)檢測(cè)雜交體的存在。 廣義上講，F(xiàn)ISH靶序列可以是DNA或RNA，既可以用來(lái)進(jìn)行基因組層面的研究，也可以進(jìn)行表達(dá)層面的研究[1]。 目前常用的熒光素有異硫氰酸熒光素、得克薩斯紅、羅丹明及其衍生物四甲基異硫氰酸羅丹明等[3]。 三．FISH的發(fā)展 熒光原位雜交技術(shù)是在同位素原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。1969年Gall和Pardue及John等分別獨(dú)立建立了同位素原位雜交技術(shù)。1974年Evans第一次將染色體顯帶技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來(lái)，提高了基因定位的準(zhǔn)確性。1975年，Manning等人最先在溶液的分子雜交中，使用非放射性標(biāo)記，通過(guò)細(xì)胞色素C將生物素與RNA分子連接起來(lái)。1977年Rudkin等發(fā)明了用間接免疫熒光法檢測(cè)目的DNA的非同位素原位雜交技術(shù)。1981年Bauman首次報(bào)道了采用熒光素標(biāo)記的探針在細(xì)胞制片上進(jìn)行基因原位雜交，建立了非放射性原位雜交技術(shù)[4, 5]。 FISH技術(shù)發(fā)展至今已40多年，一直是細(xì)胞學(xué)研究的重要手段[6]。自1990年以來(lái)，F(xiàn)ISH在方法上形成了從一種顏色到多種顏色、從中期染色體FISH到粗線染色體FISH再到纖維-FISH的發(fā)展趨勢(shì)，并且隨著物理、化學(xué)技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步，免疫染色、量子點(diǎn)和微流控芯片等不斷被引入到熒光原位雜交中，促進(jìn)了熒光原位雜交技術(shù)和分子細(xì)胞遺傳學(xué)的發(fā)展[7, 8]。 目前熒光原位雜交技術(shù)因其安全、準(zhǔn)確、方便、實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)得到了廣泛的關(guān)注及應(yīng)用。 四．FISH的應(yīng)用 熒光原位雜交技術(shù)在腫瘤診斷中的應(yīng)用 腫瘤已經(jīng)成為現(xiàn)代人類死亡的主要原因之一，腫瘤的提前確診對(duì)治療有著極大的幫助。過(guò)去診斷細(xì)胞樣本中是否含有腫瘤細(xì)胞主要用巴氏染色法等一些細(xì)胞化學(xué)染色法。新涌現(xiàn)的輔助診斷技術(shù)相比過(guò)去的方法更快捷簡(jiǎn)單，熒光原位雜交技術(shù)就是其中之一[4]。 （1）血液腫瘤學(xué) 臨床上對(duì)血液腫瘤的FISH檢測(cè)主要集中在：染色體異位形成的融合基因的檢測(cè)；基因缺失檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)一些關(guān)鍵基因的缺失，有助于疾病的診斷及預(yù)后判斷；使用熒光原位雜交技術(shù)可對(duì)微小殘留病灶進(jìn)行檢測(cè)，以及進(jìn)行造血干細(xì)胞移植狀態(tài)的監(jiān)測(cè)。 （2）實(shí)體腫瘤學(xué) 目前應(yīng)用于臨床的檢測(cè)基因突變方法以NGS和PCR為主。與FISH相比，NGS對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求高，同時(shí)存在檢測(cè)周期長(zhǎng)和檢測(cè)費(fèi)用高等問(wèn)題；熒光PCR只能夠通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行相對(duì)定量，無(wú)法做到絕對(duì)定量，數(shù)字PCR的檢測(cè)系統(tǒng)成本高，通量有限，操作繁瑣，也不能在細(xì)胞水平上觀察到基因突變的狀態(tài)，不具備定位的功能。FISH技術(shù)可以在間期細(xì)胞核上找到DNA擴(kuò)增的直接證據(jù)，而且間期細(xì)胞核所顯示出的擴(kuò)增DNA熒光信號(hào)的數(shù)量多少及熒光強(qiáng)度常與DNA擴(kuò)增的水平有關(guān)。 FISH被廣泛應(yīng)用于乳腺癌、膀胱癌，宮頸癌，肺癌和淋巴癌等實(shí)體腫瘤的輔助診斷。目前，F(xiàn)ISH主要集中用于對(duì)腫瘤的早期診斷、療效檢測(cè)，個(gè)體化治療和預(yù)后判斷等方面[9]。 熒光原位雜交技術(shù)在基因定位中的應(yīng)用 基因定位是熒光原位雜交的最基礎(chǔ)最成功的應(yīng)用。利用熒光原位雜交靈敏、準(zhǔn)確，并且可以一次檢測(cè)多段基因等特點(diǎn)，可以確定目標(biāo)基因的準(zhǔn)確位置，確定幾個(gè)基因之間的位置關(guān)系，以及基因與染色體端粒之間的關(guān)系，基因與著絲點(diǎn)的關(guān)系，是構(gòu)建基因圖譜的基本要素。目前熒光原位雜交技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于基因的物理定位及基因圖譜的繪制[4]。 熒光原位雜交技術(shù)在產(chǎn)前檢查中的應(yīng)用 產(chǎn)前診斷是優(yōu)生優(yōu)育的重要保障。染色體異常是評(píng)價(jià)重大出生缺陷性疾病的重要指標(biāo)。最常見(jiàn)的染色體異常是染色體數(shù)目異常，可能引發(fā)死胎、流產(chǎn)，即使存活也會(huì)使患病兒童畸形、生長(zhǎng)緩慢、智力低下等。利用熒光原位雜交技術(shù)可以檢測(cè)染色體非整倍體的特點(diǎn)，采集孕婦羊水，對(duì)未培養(yǎng)的羊水間期細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，確定其是否為非整倍體，對(duì)胎兒染色體異常疾病進(jìn)行診斷，使產(chǎn)前診斷時(shí)間縮短至24～48 h。熒光原位雜交的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和探針的不斷改進(jìn)，應(yīng)用熒光原位雜交方法進(jìn)行產(chǎn)前診斷對(duì)一些重大染色體異常引起的疾病確診率已經(jīng)達(dá)到99%，相較于傳統(tǒng)診斷方法更快捷，能夠減少孕婦等待的痛苦[4]。 五．FISH診斷的優(yōu)勢(shì) FISH診斷的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在經(jīng)濟(jì)安全、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高和特異性強(qiáng)等方面。 在非小細(xì)胞肺癌治療中，靶向治療是非常有效的一種新的治療方法，提高了腫瘤的治愈率。其中，表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）作為非小細(xì)胞肺癌分子靶向治療的靶標(biāo)，酪氨酸激酶抑制劑能夠?qū)GFR基因變異的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)行抑制。所以，對(duì)EGFR基因突變進(jìn)行檢測(cè)非常重要，可以為非小細(xì)胞肺癌的治療方案和預(yù)后判定提供重要信息[10]。 參考文獻(xiàn)： [1]. 熒光原位雜交技術(shù)-百度文庫(kù) [2]. 陳正啟. 全自動(dòng)熒光原位雜交系統(tǒng)裝置的研究與開(kāi)發(fā)[D].武漢紡織大學(xué),2020.DOI:10.27698/d.cnki.gwhxj.2020.000048. [3]. https://www.360doc.com/content/14/0915/15/5514788_409659718.shtml [4]. 張淼,陳瑛,吳憶寧等.熒光原位雜交技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展[J].哈爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào),2014,30(06):90-93. [5]. 佘尚揚(yáng).熒光原位雜交技術(shù)的研究進(jìn)展和應(yīng)用[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2011,5(14):129-131.DOI:10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2011.14.018. [6]. 姜春秀,姚偉,張木清等.新型寡聚核苷酸熒光原位雜交：發(fā)展與應(yīng)用[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào),2023,24(02):349-356.DOI:10.13430/j.cnki.jpgr.20220801001. [7]. 何世斌,柴連琴,譚珺雋等.熒光原位雜交技術(shù)的研究進(jìn)展[J].植物科學(xué)學(xué)報(bào),2014,32(02):199-204. [8]. 錢文丹,陳波利.熒光原位雜交技術(shù)及其應(yīng)用[J].鄉(xiāng)村科技,2018,No.193(25):51-52.DOI:10.19345/j.cnki.1674-7909.2018.25.030. [9]. 溫旺榮, 周華友主編,臨床分子診斷學(xué) 第2版,廣東科技出版社,2015.04,第72-75頁(yè) [10]. 侯舒倩.熒光原位雜交與免疫組化技術(shù)在非小細(xì)胞肺癌中的應(yīng)用比較[J].黑龍江醫(yī)學(xué),2019,43(02):160-161+164. |
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