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科研顧問_Gu新蟲 (小有名氣)
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干貨分享 | 你的生物實(shí)驗(yàn)室的緩沖液，是這些嗎？
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實(shí)驗(yàn)室中常常使用的各類溶液種類繁多，且配制方法五花八門，是否挑花眼了呢?本文總結(jié)了近三十種常用溶液、緩沖液、培養(yǎng)基的配制方法，涵蓋了分子生物學(xué)、蛋白分析、細(xì)胞培養(yǎng)、微生物培養(yǎng)等各個(gè)領(lǐng)域。 核酸電泳之 TBE、TAE 和 MOPS 緩沖液 三羥甲基氨基甲烷(Tris)是一種應(yīng)用非常廣泛的有機(jī)試劑。它及其衍生物被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的緩沖液的制備，可用于制作藥物、有機(jī)合成、生物緩沖劑等。 用途：可以用于進(jìn)行試劑的配制、蛋白質(zhì)電泳、抗原和抗體稀釋等。優(yōu)點(diǎn)：1)溶解性：Tris能夠很好地溶解在水中，便于制備不同濃度的緩沖液;2)穩(wěn)定性：Tris-HCl緩沖液在儲(chǔ)存和使用過程中穩(wěn)定性較好;3)緩沖范圍：Tris-HCl緩沖液的緩沖范圍在中性偏堿，適合保護(hù)含酶的試劑組分;4)低毒性：Tris是一種低毒性的化學(xué)品，適合用于生物實(shí)驗(yàn)。缺點(diǎn)：1)溫度效應(yīng)大：溫度變化對(duì)緩沖液pH值的影響較大;2)潛在的離子干擾：Tris-HCl緩沖液中的氯離子可能會(huì)在某些實(shí)驗(yàn)中引起干擾;3)成本：相比于PBS等緩沖液，Tris可能成本較高。 Tris鹽酸緩沖液中加入EDTA制成“TE緩沖液”，TE緩沖液是弱堿性，對(duì)DNA的堿基有保護(hù)性，因此，DNA在TE中的穩(wěn)定性較好，不易被破壞完整性或產(chǎn)生開環(huán)及斷裂，TE緩沖液被用于DNA的穩(wěn)定和儲(chǔ)存。 將調(diào)節(jié)pH值的酸溶液換成乙酸，則獲得“TAE緩沖液”(Tris/Acetate/EDTA)，將調(diào)節(jié)pH值的酸溶液換成硼酸，則獲得“TBE緩沖液”(Tris/Borate/EDTA)。TAE與TBE是使用最廣泛的緩沖系統(tǒng)。 MOPS是一種有機(jī)磺酸類化合物，由3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)配制而成, 使用濃度為0.01M-0.05M，常用的緩沖范圍在pH 6.5-7.9，最佳緩沖區(qū)間大約在pH 6.8-7.4，MOPS具有良好的水溶性和穩(wěn)定性。在RNA電泳中，MOPS緩沖劑主要通過其離子化作用來維持電泳過程中的pH穩(wěn)定，從而防止RNA的降解和變性。此外，MOPS還具有較低的離子強(qiáng)度，可以減少RNA分子之間的相互作用，提高分離效果。 TBE、TAE、MOPS作為實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)備溶液中最常見的幾種緩沖液，其緩沖能力與應(yīng)用場景卻有一些區(qū)別。TAE 的緩沖能力弱于 TBE，并且 TBE 跑膠分辨率高于 TAE。在應(yīng)用時(shí)，TBE 常用于小分子 DNA 片段電泳分析，TAE 適用于大分子 DNA 片段電泳分析及后續(xù)酶促實(shí)驗(yàn)，MOPS 則適用于更多RNA 電泳分析。 蛋白電泳緩沖液種類非常之多，需要根據(jù)凝膠體系來進(jìn)行選擇。凝膠系統(tǒng)為 Tris-甘氨酸體系時(shí)，可選擇 Tris-甘氨酸電泳緩沖液，凝膠系統(tǒng)為 Bis-Tris 體系時(shí)，可選擇 MES 或 MOPS 緩沖液，當(dāng)凝膠系統(tǒng)為 Tris-tricine 體系時(shí)，則選擇 Tricine 緩沖液。 并且，蛋白電泳緩沖液分為變性與非變性緩沖液，區(qū)別在于變性緩沖液需加入 SDS 中和電荷。我們通常研究 WB、IP 時(shí)，使用變性緩沖液研究分子量大小即可，非變性緩沖液常用于研究蛋白空間結(jié)構(gòu)、等電點(diǎn)等。 上樣緩沖液(Loading Buffer)是各類實(shí)驗(yàn)不可缺少的，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)類型選擇不同的 Buffer，以下展示 DNA 電泳 Loading Buffer、RNA 電泳 Loading Buffer 以及 SDS-PAGE Loading Buffer 的配制方法。 分子雜交包含了核酸雜交和蛋白雜交，在實(shí)驗(yàn)過程中，各類常用溶液也是必不可少的一環(huán)。使用膜雜交法時(shí)，可選擇 Denhardt's 溶液，核酸雜交中變性和清洗，可選擇 SSC 溶液、 DNA 變性緩沖液。 蛋白分析的過程，少不了轉(zhuǎn)膜液、清洗液的參與。WB 轉(zhuǎn)膜液用于將印跡從凝膠轉(zhuǎn)印至膜上，TBST 緩沖液可以用于 WB、IF、IHC 等實(shí)驗(yàn)中封閉液、一抗或二抗配制以及抗體孵育后的洗滌，WB 封閉液則可用于減少非特異性抗體結(jié)合。TBST緩沖液TBST中含有Tris-HCl，NaCl，tween20這三種物質(zhì)，是做Western Blotting中常用的一種洗膜緩沖液。目的是洗掉非特異性吸附的蛋白質(zhì)，并且維持一個(gè)接近的天然環(huán)境。 平衡鹽溶液是細(xì)胞培養(yǎng)過程中的常見溶液。在選擇平衡鹽溶液時(shí)，PBS 主要用于胚胎、組織、細(xì)胞的漂洗、凍存和培養(yǎng)，而 HBSS 除了 PBS 的用途外，還可以用于細(xì)胞培養(yǎng)試劑的配制、細(xì)胞計(jì)數(shù)的稀釋，EBSS 緩沖能力最強(qiáng)，是專為 CO2 環(huán)境中的細(xì)胞短期維持而設(shè)計(jì)。 磷酸鹽緩沖液(PBS)：由磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉按照不同比例配制而成。常用的緩沖范圍在pH5.8-8.0，使用濃度為0.1-0.2M。用途：可以用于樣本稀釋、試劑的配制、洗滌液配制等。優(yōu)點(diǎn)：1)生物相容性：PBS對(duì)蛋白質(zhì)類生物大分子相對(duì)溫和，不會(huì)引起變性或損傷;2)穩(wěn)定性：PBS在儲(chǔ)存和使用過程中穩(wěn)定性好，不易受外界環(huán)境影響;3)離子強(qiáng)度：PBS提供了適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度，有助于維持生物分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定;4)無毒性：PBS成分簡單，無毒性，適合用于生物樣本和試劑的處理。缺點(diǎn)：1)潛在的微生物污染：PBS如果不添加防腐劑，容易受到微生物的污染;2)緩沖能力限制：在極端pH變化的情況下，PBS的緩沖能力有限，可能不足以維持穩(wěn)定的pH值;3)易與常見的鈣鎂離子及金屬離子締合成沉淀。 在微生物培養(yǎng)中，LB 培養(yǎng)基當(dāng)屬最常見的，另外還有 Ampicillin 可用于篩選抗性菌，IPTG 一般用于藍(lán)白斑篩選，而 X-Gal 作為 β-半乳糖苷酶的顯色底物，常用于 β-半乳糖苷酶原位染色檢測及藍(lán)白斑篩選。 (Buffer Solution) 通常指的是由弱酸及其鹽、弱堿及其鹽組成的混合溶液，作為分析化學(xué)當(dāng)中的重要概念，緩沖液的 pH 值在一定的范圍內(nèi)可以保持穩(wěn)定，不因稀釋或加入少量酸堿而發(fā)生 pH 的改變，可以廣泛應(yīng)用于各類實(shí)驗(yàn)中。 緩沖溶液的選擇需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需維持的 pH 范圍來選擇合適的緩沖液。緩沖液作為弱酸、弱堿及其鹽的混合液，要使其具備足夠的緩沖能力，最重要的是使緩沖液中弱酸的 pKa 等于或接近于實(shí)驗(yàn)所要求的 pH 值，緩沖液中弱酸的 pKa 是選擇緩沖溶液的主要依據(jù)。 |
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