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科研戰(zhàn)神·王鐵蟲 (小有名氣)
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[交流]
一種研究RNA與蛋白質(zhì)的相互作用的實驗方法
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種研究RNA與蛋白質(zhì)的相互作用的實驗方法 RIP是指RNA Binding Protein Immunoprecipitation，同RNA pulldown相似，也是一種研究RNA和蛋白相互作用的方法，但與RNA pulldown的出發(fā)點不同， RIP是從蛋白出發(fā)研究蛋白RNA相互作用的技術(shù)。就是已知一個蛋白，把與蛋白結(jié)合的RNA富集出來并鑒定，以證實蛋白與RNA間的互作。 RIP 的基本原理 用抗體捕獲細胞核內(nèi)或細胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白。 免疫沉淀把RNA結(jié)合蛋白及其結(jié)合的RNA一起分離出來。 結(jié)合的RNA序列通過定量RT-PCR或高通量測序（RIP-Seq）方法來鑒定。 實驗方法 01 蛋白A瓊脂糖凝膠和抗體的固定 取被protein-A包裹的磁珠懸浮液，先用PBS洗滌，然后用NT2緩沖液洗滌磁珠兩次。 將NT2緩沖液和BSA添加到磁珠懸浮液中，在室溫下攪拌培養(yǎng)2小時。 將抗體添加到上述步驟得到的混合物中，然后在室溫下孵育1小時。 用NT2緩沖液洗滌protein-A包被的磁珠，然后攪拌3min，1000g，離心1min，重復(fù)此過程5次。 02 細胞裂解物的制備 將細胞先轉(zhuǎn)移至離心管，然后在4℃，1000g，離心10min； 細胞用預(yù)冷的PBS洗滌兩次； 加入與細胞等體積的RIP裂解液重懸細胞，輕輕地吹打均勻于冰上靜置5min； 每管分裝400 μL細胞裂解液，于-80℃冰箱保存； 03 免疫沉淀反應(yīng) 將上述步驟得到的細胞裂解液4 °C，14000 g，離心10 min； 取清液到一個新的離心管中，4 °C，14000 g，離心5 min，再將上清液再轉(zhuǎn)移至另一個新的管子中； 在制備的上清液中加入10倍體積的NET-2buffer重懸的磁珠，吹打混勻； 取約10%的樣品作為“Input”備份，−80 °C保存?zhèn)溆茫?br /> 在裂解液中加入10倍體積的NET-2 buffer重懸的磁珠，作為陰性對照； 接著在4℃恒溫攪拌下孵育12-16h； 孵育后，離心分離protein-A包被的磁珠，取出10%上清備份“output”； 用NT2緩沖液洗滌磁珠，將其重懸后并混合3min，然后4℃，1000 g離心，重復(fù)6次。 RNA的分離與分析 將Trizol加入到等體積的磁珠中，并將混合物重新懸浮，RNA立即被分離或冷凍在液氮中。 檢測RNA的濃度和質(zhì)量，并通過RT-PCR和測序鑒定RNA. RIP實驗中常見問題及解決辦法 非特異性RNA的結(jié)合過高 在室溫下攪拌培養(yǎng)2小時，可以減少mRNA與磁珠的非特異性相互作用。 分離得到的RNA水平過低 實驗過程中需確保細胞中有足夠水平的蛋白質(zhì)。 |
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