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實驗技巧 | 細胞劃痕，滿滿干貨
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細胞劃痕(wound healing）法是簡捷測定細胞遷移運動和修復能力的方法。 一、原理 在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細胞上，用微量槍頭或其它硬物在細胞生長的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細胞至實驗設定的時間，取出細胞培養(yǎng)板，在顯微鏡下觀察并拍照記錄特定位置細胞的生長遷移能力。 通過不同分組之間的細胞對于劃痕區(qū)修復能力的不同，可以判斷各組細胞的遷移與修復能力的差別。 二、步驟 1、準備： 所有能滅菌的器械都要滅菌，直尺和 marker 筆在操作前紫外照射 30 min（超凈臺內(nèi)） 2、流程： 1. 培養(yǎng)板劃線：先用 marker 筆在 6 孔板背后，用直尺比著，均勻得劃橫線，大約每隔 0.5~1 cm 一道，橫穿過孔，每孔至少穿過 5 條線； 2. 鋪細胞：在孔中加入約 5×105 個細胞，具體數(shù)量因細胞不同而不同，掌握為過夜能鋪滿； 3. 細胞劃線：第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜； 4. 洗細胞：用 PBS 洗細胞 3 次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基； 5. 細胞培養(yǎng)及觀察：放入 37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱，培養(yǎng)；按 0，6，12，24 小時取樣，倒置顯微鏡觀察特定位置細胞遷移情況并拍照； 6. 結果分析：使用 Image J 軟件打開圖片后，隨機劃取 6-8 條水平線，計算細胞間距離的均值。 三、注意事項 1、鋪細胞最好使用 6 孔板，因為 6 孔板可以保證有相當距離的平直劃痕，而且因為有 5 條定位線，與劃痕相交，這樣就有10 個可固定監(jiān)測點，不作重復，誤差也很小。 2、如果你連續(xù)監(jiān)測 24 小時，你需要考慮到劃痕縮小是細胞遷移和細胞繁殖共同作用的結果，而不是單純的細胞遷移。 如果你要單純的考慮細胞遷移，你可以先用絲裂霉素（1 ug/ml）處理一小時，抑制細胞的分裂，這樣你的結果就是細胞遷移的作用了。另外，使用無血清培養(yǎng)基也可以降低增殖對實驗結果的影響。 3、照片拍完之后，可以用 ImageJ 來測量劃痕區(qū)域的像素定量比較細胞遷移的速度。 4、雖然無血清培養(yǎng)可以忽略細胞增殖的影響，但是由于細胞內(nèi)信號傳導系統(tǒng)整體性的下調(diào)節(jié)，細胞遷移的速度也會慢很多。 5、應盡量清洗掉散落的細胞，對于一些細胞，低血清濃度下也能重新貼壁并增殖，此外也影響數(shù)據(jù)美觀。 四、常見問題 1.劃痕法測量適用的細胞范圍較小，一般只適用于上皮細胞，纖維樣細胞。 2.雖然無血清培養(yǎng)可以忽略細胞增殖的影響，但是由于細胞內(nèi)信號傳導系統(tǒng)整體性的下調(diào)節(jié)，細胞遷移的速度也會慢很多。 3、在用 PBS 緩沖液沖洗時，注意貼壁慢慢加入，以免沖散單層貼壁細胞，影響實驗拍照結果。 4、一般做劃痕實驗，需要排除細胞增殖的影響，一般在不影響細胞增殖的情況下采用低血清（<2%）或者無血清，否則細胞增殖就不能忽略，這樣對于遷移較慢的細胞就需要延長拍攝時間（也可用絲裂酶處理一小時）。 5、按照 6 孔板背后畫線的垂直方向劃痕，可以形成若干交叉點，作為固定的檢測點，以解決了前后觀察時位置不固定的問題。 6、每次拍照前、后，盡量換掉培養(yǎng)基，去除飄落的細胞，能得到較為干凈的劃痕區(qū)域。 |
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